Los estudios funcionales de los genes de Rickettsia son cruciales para comprender su papel en la patogénesis, por lo que necesitamos métodos confiables para alterar los genes de manera controlada. Nuestro protocolo utiliza la electroporación para introducir ADN exógeno en bacterias intracelulares obligadas del género Rickettsia, lo que nos permite estudiar los efectos del ADN introducido. Demostrando el procedimiento junto conmigo hoy estará Lisa Price, investigadora del Dr. Munderloh y del laboratorio del Dr. Kurtti.
Para comenzar, prepare un cultivo de células ISE6 infectado con Rickettsia parkeri al 90 a 100% como se describe en el texto. Luego, para determinar la tasa de infección por tinción de Giemsa, diluya la suspensión celular a una proporción de 1: 5 con medio completo y deposite 100 microlitros de la suspensión celular en un portaobjetos de microscopio de vidrio por centrifugación a 113 G durante cinco minutos. Después de dejar que la diapositiva se seque al aire, fíjela en un metanol absoluto durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Luego, incuba el tobogán y tinción de Giemsa durante 30 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, enjuague el portaobjetos en agua y una vez seco, véalo bajo un microscopio óptico con objetivos de aceite. Determine el porcentaje de células infectadas contando las células infectadas y no infectadas.
Para preparar el Rickettsia parkeri libre de células, vierta aproximadamente 0,2 mililitros de arena estéril de carburo de silicio de 60 a 90 en dos tubos de microcentrífuga estériles de dos mililitros y deje los tubos a un lado. De un matraz previamente inoculado infectado con Rickettsia parkeri que contenga cinco mililitros de medio, extraer dos mililitros del medio, teniendo cuidado de no perturbar la capa celular. Luego, resuspenda las células con los tres mililitros restantes del medio.
Divida esta suspensión en partes iguales entre los dos tubos de arena de carburo de silicona preparados y haga un vórtice del tubo a alta velocidad durante 30 segundos. Luego, colócalos en hielo. A continuación, prepare una jeringa luer lock estéril de cinco mililitros extendiendo el émbolo e inserte el extremo del émbolo en una base de poliestireno utilizada para sostener tubos cónicos de 15 mililitros.
Usando una pipeta Pasteur de barrera de dos mililitros operada con una bombilla de goma, retire cuidadosamente el sobrenadante de las células de vórtice sin aspirar ningún grano. A continuación, inserte la punta de la pipeta en la abertura del cubo de la jeringa y expulse el contenido en la jeringa con una presión suave. A continuación, filtre el cultivo de Rickettsia parkeri en tubos estériles de 1,5 mililitros a través de un filtro estéril de dos micrómetros de tamaño de poro instalado en el cubo de la jeringa y centrifugar los tubos a 13, 600 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Después de retirar el sobrenadante, lave el pellet celular dos veces con 1.2 mililitros de solución de sacarosa helada de 300 milimolares. Centrifugar la muestra y retirar el sobrenadante entre lavados. Al final de la centrifugación, resuspender el pellet de celda agrupado con 100 a 150 microlitros de solución de sacarosa helada para dos o tres muestras de transformación, respectivamente.
Luego, divida la muestra en alícuotas de 50 microlitros en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 microlitros preenfriados. Para la transformación a tres microgramos de ADN plásmido pRAM18sSFA libre de endotoxinas a cada tubo que contiene 50 microlitros de Rickettsia parkeri en hielo y agitar suavemente con una punta de pipeta. Transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación estéril preenfriada con un espacio de 0,1 centímetros.
Golpee suavemente la cubeta para distribuir la mezcla uniformemente e incubar en hielo durante 10 a 30 minutos. Mientras tanto, retire el medio de un matraz de cultivo celular ISE6 previamente cultivado completamente confluente y resuspenda la capa celular enjuagando suavemente las células con 1,5 mililitros de medio fresco que contenga bicarbonato de sodio y tampón HEPES. Después de generar una suspensión celular homogénea, transfiera todo el volumen a un solo tubo de microcentrífuga estéril de dos mililitros.
A continuación, electroporate la mezcla de ADN de Rickettsia parkeri y plásmido usando un electroporador. Después de la electroporación, use una pipeta estéril extendida de punta fina para transferir una pequeña cantidad de la suspensión de células ISE6 a la cubeta y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para recuperar la Rickettsia parkeri electroporada. Luego, transfiera el contenido de la cubeta al tubo de dos mililitros que contiene el resto de la suspensión de celdas ISE6.
A continuación, centrifugar la muestra a temperatura ambiente, primero a 700 G durante dos minutos para bajar las células ISE6, y luego a 13, 600 G durante un minuto para bajar la Rickettsia. Incubar el tubo a 34 grados centígrados durante 15 minutos a una hora. Después de la incubación, transferir el contenido resuspendido de una transformación a un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados que contenga 3,5 mililitros de medio fresco con bicarbonato de sodio y tampón HEPES.
Mece el matraz para esparcir la mezcla uniformemente e incubar a 34 grados centígrados. Después de 16 a 24 horas, añadir 10 microlitros de espectinomicina y estreptomicina en el matraz incubado. Meca el matraz para mezclar los antibióticos uniformemente en el medio antes de devolverlo a la incubadora.
La propagación exitosa de células salvajes de Rickettsia parkeri e ISE6 fue evidente por la tinción de Giemsa. Los núcleos de las células ISE6 teñidas de púrpura oscuro con Giemsa en el Rickettsi intracelular y extracelular son visibles. La transformación de Rickettsia parkeri expresando la proteína de fluorescencia roja en células ISE6 se confirmó mediante microscopía confocal después de siete días de incubación.
Se observó un aumento sustancial en la tasa de infección después de 10 días. Mantenga todo estéril durante todo el procedimiento. Preste atención a los detalles y sea paciente, ya que algunas especies de Rickettsia tardan mucho tiempo en transformarse, especialmente los endosimbiontes de crecimiento lento.
Este protocolo ha permitido el estudio de múltiples aspectos de la biología de Rickettsia y sus interacciones con sus artrópodos vectores y huéspedes mamíferos. Por ejemplo, Rickettsi que expresa proteínas fluorescentes se ha utilizado para rastrear la motilidad y las interacciones simbiontes de las células de garrapata.
