El pez cebra transgénico ha demostrado ser fundamental para nuestra comprensión del desarrollo embrionario. El sistema Tol2 es una herramienta versátil que permite a los investigadores generar rápida y sistemáticamente múltiples peces cebra transgénicos para estudios de TEAF. El diseño modular y la facilidad de generación de nuevos componentes del kit hacen del sistema Tol2 una herramienta versátil para generar nuevos transgénicos sin tener que rediseñar ningún componente del kit.
Mi consejo para los investigadores que realizan esta técnica por primera vez es hacer varias pruebas para entrenar la precisión de generar e inyectar construcciones transgénicas. Para comenzar, linealice el plásmido kit Tol2 que contiene transposasa con una endonucleasa de restricción cero combinando 10 microlitros de plásmido transposasa, 1.5 microlitros de tampón de reacción de endonucleasa de restricción y 0.3 microlitros de ninguna endonucleasa en un tubo de microcentrífuga de 500 microlitros. Llene la reacción hasta 20 microlitros con agua libre de ARNasa.
Mezclar y digerir a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, detenga la digestión agregando un microlitro de 0.5 molar EDTA, dos microlitros de acetato de amonio molar y 80 microlitros de etanol al 100% a la mezcla de reacción. Mezcle y enfríe a menos 20 grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, centrifugar y aspirar el sobrenadante antes de resuspender el pellet de ADN en agua libre de ARNasa. Luego determine la concentración lineal de plásmidos en nanogramos por microlitro en un fluorómetro ejecutando dos microlitros de la muestra. Configure la producción de ARNm SP6 combinando 10 microlitros de 2X NTP/CAP, dos microlitros de tampón de reacción 10X, 0.1 a un microgramo de plantilla de ADN lineal en dos microlitros de mezcla de enzimas SP6 en un tubo de 500 microlitros.
Llene la reacción hasta 20 microlitros con agua libre de ARNasa y mezcle antes de incubar a 37 grados centígrados. Después de dos horas, agregue un microlitro de DNAse, mezcle bien e incube durante 15 minutos adicionales. Detenga la reacción agregando 30 microlitros de solución de precipitación de cloruro de litio.
Mezcle y enfríe a menos 20 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, centrifugar la solución para granular el ARNm y aspirar el sobrenadante antes de lavar el pellet con un mililitro de etanol al 80%. Seque al aire el pellet y vuelva a suspenderlo en 20 microlitros de agua libre de ARNasa.
Determine la concentración de ARNm usando un fluorómetro, luego alícuota 100 nanogramos de ARNm por tubo para un solo uso y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Para realizar la reacción, reúna 10 femtomole de P5E, PME y P3E y 20 femtomole del vector de destino PDEST. Identifique el tamaño de los cuatro vectores y pares de bases de la fuente de plásmidos.
Después de determinar la concentración de los cuatro vectores, utilizando el peso del ADN como 660 gramos por mol y el tamaño del plásmido y los pares de bases, calcule el total de nanogramos de plásmido necesarios para alcanzar 10 femtomole para los vectores de entrada o 20 femtomole para el vector de destino. A continuación, genere la construcción sox17:EGFP-CAAX utilizando los componentes descritos en el manuscrito. Usando la concentración de plásmidos, calcule los microlitros totales de cada plásmido necesarios para alcanzar 10 femtomole o 20 femtomole, y luego divida esto por dos para el uso en las reacciones de cinco microlitros a mitad LR.
Generar 10 femtomole de P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) y 20 femtomole de vector de destino. Configure cinco microlitros de reacción mitad LR combinando los volúmenes de P5E, PME, P3E y PDEST en un tubo de 500 microlitros. Luego agregue agua estéril para hacer el volumen de cuatro microlitros.
Mezcle la enzima LR dos veces durante un minuto cada una antes de agregar un microlitro a la reacción y mezcle bien antes de incubar a 25 grados centígrados. Al día siguiente, detenga la reacción LR agregando 0.5 microlitros de proteinasa K.Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos y luego enfriar a temperatura ambiente. A continuación, transforme de tres a cuatro microlitros del plásmido en células químicamente competentes descongeladas agregando el plásmido y dejando que las células reposen en hielo durante 25 a 30 minutos.
Luego choque térmico las células en un baño de agua de 42 grados centígrados durante 30 segundos. Después del choque térmico, agregue 250 microlitros de medios líquidos ricos sin antibióticos a las células e incube agitando a 37 grados centígrados durante 1,5 horas. Extienda 300 microlitros de suspensión bacteriana en una placa de ampicilina Luria-Bertani e incube durante la noche.
Al día siguiente, examinar las colonias para detectar la presencia de dos fenotipos: claro y opaco. Elija las colonias claras una a la vez, inocule el cultivo líquido y agite a 37 grados centígrados durante la noche. Combine 150 nanogramos de plásmido, 100 nanogramos de ARNm transposasa y 2% de rojo fenol en hielo.
Luego agregue agua libre de ARN para hacer el volumen de tres microlitros. Transfiera un embrión en estadio celular utilizando pipetas de transferencia a la placa de inyección llena de EM que cubre completamente el agar y luego presione suavemente aproximadamente de 50 a 75 embriones por ranura de la placa de inyección. Agregue la mezcla de rojo fenol plásmido de ARNm al extremo abierto de una aguja de inyección capilar.
Coloque la aguja capilar en la armadura del equipo de inyección y encienda el equipo de inyección. Baje la aguja en la placa de inyección y rompa la punta con pinzas para permitir que la plataforma de inyección bombee solo una pequeña cantidad de mezcla. Inyecte los embriones con un bolo de tres nanolitros de la mezcla de rojo fenol plásmido de ARNm en el cuerpo celular del embrión.
Cuando termine, retire los embriones de la placa de inyección sacándolos suavemente de la ranura y transfiera el pipeteo a una placa de Petri de 100 milímetros con EM fresca. Incubar a 28,5 grados centígrados. Elija la etapa de desarrollo apropiada para la expresión de transgenes fluorescentes y realice pruebas bajo un microscopio de disección fluorescente. Detectar transgenes no fluorescentes mediante la detección de marcadores transgénicos fluorescentes como GFP impulsados por el promotor cardíaco específico para el gen Cmlc2.
Cuando los embriones positivos para la inserción transgénica se conviertan en adultos y alcancen la edad reproductiva, selecciónelos individualmente para detectar la transmisión de la línea germinal y la expresividad transgénica criándolos en pez cebra de tipo salvaje. Se muestran ejemplos de colonias bacterianas obtenidas de la transformación de la recombinación LR. Las colonias claras contenían un producto de recombinación LR correcto más del 85% del tiempo, mientras que las colonias opacas nunca contenían un producto de recombinación correcto.
La digestión diagnóstica de las tres colonias a partir de la transformación de los productos de recombinación LR mostró que la única colonia opaca no contenía ningún plásmido, mientras que las dos colonias claras contenían una sola banda en 9, 544 pares de bases. El ARNm de transposasa en 1, 950 pares de bases se muestra aquí. Se observó expresión de EGFP-CAAX del endodermo en mosaico en el 75% de los embriones inyectados.
La expresión del marcador transgénico de Cmlc2 EGFP en el corazón en desarrollo se observó 24 horas después de la fertilización. El pez cebra adulto tenía transmisión germinal de sox17:EGFP-CAAX generó embriones fluorescentes con el endodermo completamente marcado con EGFP-CAAX. Tanto la longitud anterior-posterior del endodermo como la longitud dorsal-ventral de cada bolsa de las bolsas uno a cinco se midieron en embriones mutantes BMP de tipo salvaje controlados y tratados con etanol.
La longitud total del endodermo no se vio afectada por el genotipo o el tratamiento. Sin embargo, las bolsas uno y tres mostraron aumentos significativos en la longitud de la bolsa entre embriones de tipo salvaje no tratados y tratados con etanol, pero disminuciones significativas en la longitud entre los mutantes BMP no tratados y tratados con etanol. La bolsa dos mostró aumentos significativos en el tamaño de la bolsa entre los grupos de tipo salvaje no tratado y tratado con etanol y BMP, respectivamente.
Al intentar este procedimiento, es fundamental ser preciso en el pipeteo y la dilución del sistema Tol2, así como golpear el cuerpo celular durante la inyección del embrión.
