Los animales de las cuevas proporcionan un sistema convincente para investigar diversos rasgos morfológicos, de desarrollo y de comportamiento. Pero uno de los factores limitantes para establecer este sistema modelo es la falta de herramientas genéticas que nos permitan manipular la función génica. Aquí demostramos tres enfoques diferentes para manipular la función genética en el pez cueva mexicano, Astyanax mexicanus.
Estas herramientas permitirán la investigación de los genes subyacentes a las variaciones naturales entre los peces superficiales y los peces de las cuevas y cómo se relacionan con los fenotipos. Bethany Stahl, un talentoso postdoctorado en mi laboratorio demostrará este procedimiento. Antes de comenzar el procedimiento, llene un plato de Petri de 100 mililitros con 3% de agarosa caliente disuelto en agua del sistema de pescado y coloque cuidadosamente un molde de inyección de huevo en la agarosa en un ángulo de 45 grados, antes de bajar lentamente el molde en la agarosa para evitar atrapar el aire bajo el moho.
Cuando la agarosa se haya solidificado, retire cuidadosamente el molde y guárdelo a cuatro grados centígrados durante una semana. A continuación, tire de las agujas de los capilares de vidrio de borosilicato y de un tirador de aguja de electrodo de acuerdo con las directrices del fabricante. El día de la inyección, utilice una pipeta de vidrio para transferir huevos de una sola célula a la placa de inyección, llenando hasta cinco filas de la placa de inyección con 30 a 40 huevos por fila.
Mantenga los huevos hidratados con una pequeña cantidad de agua del sistema de pescado. Descongele Morpholino sobre hielo y prepare la solución inyectable de modo que se inyecten 400 picogramos de Morpholino por óvulo utilizando una punta de pipeta microcargadora larga o añadiendo un bolo de dos a cuatro microlitros al final. Cuando se hayan cargado todas las agujas, utilice fórceps para recortar la longitud sobrante de las puntas de la aguja de inyección y monte la primera aguja en un micromaniprógrafo conectado a un microinyector de picolitros.
A continuación, coloque la placa de inyección bajo un microscopio de disección y utilice el micromanibultor para penetrar cada huevo con la aguja antes de inyectar un nanolitor de la solución de inyección de Morpholino directamente en la yema. Para la inyección de CRISPR, mezcle 25 picogramas de ARN guía con 300 picogramas de ARN mensajero de proteína 9 asociado a CRISPR e inyecte dos nanolitros de la solución de ARN resultante en cada embrión como se ha demostrado. Para la transposasa Tol2 y la inyección de plásmido flanqueado Tol2, combine 25 nanogramos por microlitro de ARN mensajero Tol2 con 25 nanogramos por microlitro de construcción de plásmido Tol2 y rojo fenol en agua libre de RNase.
A continuación, inyecte un nanolitr de solución en cada embrión como se acaba de demostrar. Para examinar los animales inyectados por Morpholino a los cuatro días posteriores a la inyección, dependiendo del gen de interés, visualizar las larvas de pescado bajo un microscopio estéreo para observar el fenotipo de los animales inyectados o el registro de vídeo para medir el comportamiento. Para detectar indels CRISPR, transfiera embriones inyectados con CRISPR a tubos de PCR y extraiga el ADN de acuerdo con los protocolos estándar de extracción de ADN para la reacción en cadena de la polimerasa o el análisis de PCR.
Para evaluar la mutagénesis, ejecute cinco microlitros del producto PCR en un gel de 3% de agarosa a 70 voltios durante tres horas. El ADN no mutagenizado de tipo salvaje resultará en una banda distinta, mientras que el ADN mutante resultará en una banda tipo. Cave A mexicanus inyectado con un control Morpholino exhibe significativamente más actividad locomotora y reduce el sueño durante un período de 24 horas, en comparación con los peces superficiales inyectados con un Morpholino revuelto.
La inyección de la hipocretina orexin Morpholino tiene poco efecto sobre el sueño en peces superficiales en comparación con los peces inyectados por control. Por el contrario, el derribo de hipocretina orexin a través de la inyección de Morpholino tiene un efecto significativo en el sueño en peces que habitan en cuevas, proporcionando un vínculo directo entre la expresión de hipocretina orexin y la pérdida del sueño. La mutagénesis mediada por CRPSR del gen del albinismo OCA2 en peces de superficie da como resultado algunos individuos homocigotos para el alelo positivo OCA2 de tipo salvaje, y se asocia con la pigmentación del puerto, mientras que los individuos que tienen dos copias del alelo negativo OCA2 mutado por CRISPR son albinos, proporcionando un vínculo directo entre el gen mutante OCA2 y el albinismo en los peces de cueva.
Seleccione F0 positivo para el Transgén transmitido Tol2 para volver a cruzar al tipo salvaje para generar líneas F1 estables. Esto permite la toma de imágenes de calcio en vivo para descubrir diferencias en la actividad neuronal, mediando los cambios de comportamiento en el entorno de la cueva, sentando las bases para la expresión de muchos transgenes adicionales para caracterizar y manipular la función génica en A mexicanus. Lo más importante a recordar es cargar los huevos firmemente sobre la placa, recortar la aguja correctamente y optimizar la microinyección.
Después de un golpe genético exitoso, integración de transgénes o edición de genes mediado por CRISPR, estos peces se pueden utilizar para análisis de desarrollo, comportamiento y actividad cerebral.
