Damos las gracias a la Dra. Jennifer Emtage para la lectura crítica del manuscrito, Ryan Gill para la asistencia técnica y ayuda con el cuidado de pez cebra y el Dr. Stephen C. Ekker (Clínica Mayo, Rochster, Minnesota) para los reactivos. Nuestro trabajo ha sido apoyado por Temple University College de Ciencia y Tecnología y el Instituto Nacional de Salud (R01-HD061749).

1. La producción de la generación F0 por microinyección de la Trampa de Gene. Hemos encontrado que los embriones de diferentes orígenes genéticos muestran diferentes tolerancias a este procedimiento, con el tipo salvaje basado pet-store-and Tubinga - Long Fin (TLF) el más tolerante mientras que las cepas AB y Tubinga tienen peor supervivencia. <ol><li> Preparación de ADN transposón. Preparar GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al., En preparación) ADN plásmido utilizando el kit QIAprep miniprep estándar (Qiagen 27106). Es esencial incluir la etapa de lavado PB (que es opcional en el procedimiento QIAprep), de lo contrario el ADN miniprep se contaminará por la RNasa A, que conduce a la degradación del ARNm de la transposasa. Antes de la inyección, se diluye la DNA en agua libre de RNasa (Ambion AM9937) a 10 ng / l. </li><li> Preparación de ARNm de transposasa. Linealizar pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 utilizando XbaI y transcribir el ADN linearizado utilizando una máquina T3 mMessage(Ambion AM1348) en el kit de transcripción in vitro. Hemos modificado la reacción de transcripción in vitro por la adición de 0,5 l de inhibidor de RNasa RiboLock (ThermoFisher Fermentas EO0381). Después de la etapa de tratamiento DNasa, purificar mRNA utilizando un kit RNeasy MinElute (Qiagen 74204). Evaluar la calidad de la vitro ARNm transcrito por electroforesis en gel de agarosa. Diluir el mRNA en RNasa libre de agua a 40 ng / l, y almacena como 2 alícuotas a -80 ° C. </li><li> Preparación de la mezcla de microinyección. Antes de la inyección, añada 8 l de ADN transposón diluido a una alícuota de 2 l de mRNA transposasa. </li><li> La microinyección. Inyectar 3 nl de mezcla de ADN / ARN en la yema de 1 embriones de pez cebra celular utilizando técnicas de microinyección estándar, con el objetivo para el interfaz yema / blastómeros. Recoger los embriones cada 20 minutos para asegurar la inyección en la etapa celular 1. En nuestra experiencia, una persona hábil puede inyectar fácilmente 1.000 embriones en 1-1.5 horas. </li><li> Después de la inyección, ejecute 5 l de izquierdamás de la solución de inyección en un gel de agarosa al 1% para el control de calidad, para asegurar que el ARNm de la transposasa no se ha degradado. </li><li> Cuidado embrión inyectado. En la tarde, eliminar embriones fecundados y anormales y distribuir embriones de 60 a 80 por cada 100 mm placa de Petri. Embriones anormales y muertas se eliminan después de la fecundación en 1 día (dpf), 2 dpf y 3 dpf. </li><li> La detección de la expresión de GFP. Embriones pantalla sin defectos manifiestos de la fluorescencia de GFP en 3 fdd (Figura 3). La detección puede hacerse ya sea en un microscopio estereoscópico equipado con fluorescencia (Nikon usamos un SMZ1500) o en un microscopio vertical (usamos un Zeiss AxioImager con un objetivo de 5X Fluar). Bajo la expresión de GFP indica la inyección sin éxito o la degradación de ARN transposasa debido a la contaminación de RNasa (Figura 3A). Seleccionar aproximadamente el 30% de los embriones más brillantes que, o bien tienen la expresión de GFP en varios tejidos o en un alto porcentaje de células de un tejido específico (comparar Figuras 3B y 3C). Desde una inyección de 1.000 embriones, por lo general tienen un máximo de 100 altas que expresan GFP embriones de desarrollo normales,. </li><li> Levante embriones F0 seleccionados mediante procedimientos de cría de peces cebra normales. Es razonable esperar que el 20-30% de los embriones inyectados seleccionados para la cría va a sobrevivir hasta la edad adulta. </li></ol> 2. Mantenimiento de los UAS: mRFP Tester Line. Hemos generado un 14xUAS: Línea mRFP marcado por γCry-lente específica: las buenas prácticas agrarias. Desde UAS está sujeta a silenciar a través de la metilación del ADN, es importante seleccionar el pescado con niveles bajos de silenciamiento para propagar la acción. <ol><li> Configure UAS individuo: homocigotos mRFP para aparearse con uno de nuestros más confiables Gal4 trampa líneas gene, tpl6 nsf (Balciuniene y otros en preparación.). </li><li> En el día siguiente, transferir la UAS: peces mRFP que dieron los embriones a los tanques estáticos individuales, mientras que se recogen los embrionesy limpiado. </li><li> Embriones de malla para las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia a 1 dpf y 3 dpf. </li><li> Peces Intercross que dio embriones con alta expresión mRFP para establecer la próxima generación de UAS: Línea mRFP. </li></ol> 3. Proyección de la F0 Fish. <ol><li> Cruce F0 individual con la UAS homocigotos: peces mRFP (Figura 4). Por lo general, inyectamos nuestros GBTS en líneas con patrones de tipo salvaje o de pigmentación de leopardo, y nuestros UAS homocigotos: Línea mRFP es en latón. Por lo tanto los peces inyectados F0-GBT puede diferenciarse fácilmente de los UAS: peces mRFP, eliminando la necesidad de registrar si el F0 estar estudiadas era un hombre o una mujer, así como los posibles errores resultantes de errores en el registro y / o que determinan el sexo de cada pez. Por lo tanto, personal con experiencia muy limitada, tales somos estudiantes universitarios, son capaces de crear y romper los apareamientos de pescado. Este enfoque tiene la desventaja de que dos fondos genéticos diferentes sonsiendo utilizado, complicando potencialmente la interpretación de la pérdida de función de fenotipos. </li><li> Al día siguiente, devolver los UAS de latón: peces mRFP a su tanque. Coloque el pescado F0 que dio embriones en tanques estáticos individuales (usamos Hagen Exo Terra Faunarium Pequeño, pero cualquier pequeño tanque se puede utilizar para este propósito), mientras que los embriones son recogidos y examinados. </li><li> Limpie y transferencia de embriones recolectados en nuevas placas de Petri (&lt;100 por placa) en la tarde del día 0. </li><li> Embriones de malla para las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia a 1 dpf, 2 y 3 fdd fdd. Tire de embriones positivos tanto para las buenas prácticas agrarias y RFP, ordenarlas por patrón de expresión de GFP / RFP (si más de un patrón se observa en un embrague) y criarlos para establecer la generación F1. </li><li> La eutanasia a los peces F0 que produjo sólo los embriones negativos (de un total de 50 a 100 embriones). </li><li> Cruce el pescado F0 que produjo GFP / progenie RFP-positivo de nuevo para obtener una segunda tanda de positivos. </li></ol> 4.Proyección de la F1 Fish. El pescado F1 son examinados para establecer familias F2, para documentar el patrón de expresión de genes y la trampa para congelar lotes de embriones para la identificación molecular de trampa de genes loci por 5 &#39;RACE y PCR inversa. <ol><li> Cruce de pescado individual F1 con la UAS homocigotos: peces mRFP (Figura 4). </li><li> Al día siguiente, coloque el pescado F1 que le dio a los embriones en tanques estáticos individuales, mientras que los embriones son recogidos y examinados. </li><li> Embriones de malla para las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia a 1 dpf, 2 y 3 fdd fdd. Embriones separados y fotografiar positivos tanto para las buenas prácticas agrarias y RFP 24. </li><li> A las 5 dpf, congelar lotes de 20 GFP / RFP-positivo y 20 GFP / embriones-RFP negativo para la identificación de genes mutados insertionally mediante PCR inversa y 5 &#39;RACE 9,10. Levante restantes GFP / embriones RFP-positivas para establecer la generación F2. </li></ol>

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Estos autores no tienen nada que revelar.

Los vectores de genes trampa y la metodología descritos aquí ya están siendo utilizados en varios laboratorios independientes. En nuestra experiencia, hay dos pasos fundamentales en el proceso. El primer paso fundamental es lograr altos índices de integración trampa de genes en embriones inyectados F0. El fracaso en este paso a menudo se puede atribuir a la contaminación de RNasa de los reactivos de inyección, especialmente el ADN miniprep. También es muy importante para inyectar embriones en la etapa de 1 célula para atrapar gen experimentos. En nuestra experiencia, la transgénesis mediada por Tol2 es muy eficiente, por lo que es posible la obtención de líneas transgénicas incluso cuando se inyecta más tarde de la etapa 1 con el ADN celular o de menor calidad. Inyecciones de baja calidad es mucho más problemática cuando se lleva a cabo mutagénesis de trampa de genes, ya que sólo una pequeña fracción de las integraciones vector resulta en eventos efectivos de genes trampa. El segundo paso crítico es determinar los eventos de trampa de genes cruzando a nuestro UAS: Línea mRFP. Ausencia de expresión mRFP escasi siempre indicativa de un evento potenciador trampa. Sin embargo, a veces la falta de expresión mRFP puede indicar el silenciamiento de los 14x UAS. Por tanto, es importante mantener los UAS: Línea mRFP en un estado no silenciada mediante la propagación de la próxima generación utilizando individuos con alta expresión de RFP cuando se cruzan a tpl6 nsf. Podemos prever hacer una serie de mejoras a nuestros vectores de genes trampa y protocolo. El primero es el uso de un UAS menos repetitivas en la trampa de genes constructo. Se ha demostrado que una 5x UAS es suficiente para lograr la activación completa en experimentos de cultivo de células, y que las secuencias UAS menos repetitivas son menos susceptibles a la metilación y el silenciamiento de 6,25. También puede ser posible diseñar vectores trampa de genes para la mutagénesis totalmente condicional, en analogía a los vectores utilizados por el ratón trampa de genes consorcio internacional y recientemente adaptados para el pez cebra 2,26,27. Otra mejora sería utilizar un t diferentesistema ransposon, por ejemplo la bella durmiente 28, para generar un UAS: Línea reportero mRFP. Esto permitiría la inyección de trampas de genes basados ​​en Tol2 directamente en la línea de reportero y el cribado de F0s por incrossing. Además, esto eliminaría el uso de dos fondos genéticos diferentes, por lo que la interpretación de la pérdida de función de los fenotipos más sencillo. Incluso con estas mejoras, el Gal4 trampa de genes protocolo general que se presenta aquí seguiría siendo plenamente aplicables.

Mutagénesis insercional ha demostrado ser un enfoque poderoso para la disección de la función de genes en diversos sistemas modelo a partir de organismos unicelulares como las bacterias y levaduras para los organismos multicelulares tales como los ratones y las plantas. Cualquier ADN exógeno (virus, plásmido o transposón) puede servir como un mutágeno mediante la interrupción de los elementos esenciales de los genes tales como exones o promotores. El objetivo efectivo de tales enfoques simples es extremadamente pequeña en grandes genomas complejos, ya que los exones representan sólo el 1-3% de un genoma típico de los vertebrados. Tamaño de destino efectivo pequeño puede ser superada por las tasas de integración muy alto por vectores, como lo demuestra el tremendo éxito de la mutagénesis de inserción retroviral en el pez cebra 11,12. Por el contrario, los intrones comprenden aproximadamente el 20-30% de los genomas de vertebrados. En el pez cebra, vectores de mutagénesis de inserción basado en transposón que introducen efectivamente nulo o hypomorphic mutaciones severas sobre la integración en los intrones se han llamado &quot;gen romper transposons &quot;(GBTS) 8-10. Para la integración eficiente trampa de genes, que utilizan un transposón mínima Tol2 13,14. Mutagenicidad de GBTS se basa en peces derivados de aceptor de empalme y secuencias de terminación / poliadenilación de la transcripción. Los elementos responsables de GBT mutagenicidad están flanqueadas por sitios loxP directos para la escisión por la recombinasa Cre. Por lo tanto, la inyección de ARNm de Cre conduce a la reversión eficiente de mutaciones inducidas por GBT, a pesar de que algunas secuencias de transposones permanecen en el locus de integración de 9,10. Los vectores GBT recientemente publicados utilizan mRFP como el reportero 9,10 trampa de genes, dando lugar a dos posibles deficiencias. En primer lugar, no se sabe qué fracción de los genes de pez cebra se expresa a un nivel lo suficientemente alto para ser detectados por las proteínas de fusión reportero directos fluorescentes. En segundo lugar, se espera que sólo un pequeño subconjunto de los genes que tienen funciones esenciales. Se ha estimado que sólo hay 1,400-2,400 genes necesarios para desarroll pez cebrant 15,16. No se espera que la mayoría de los mutantes de genes trampa para mostrar fenotipos abiertas y por lo tanto tendrá una utilidad limitada. Para superar estas dos limitaciones, hemos modificado GBT-R15 9,10 a utilizar con Gal4-VP16 como el reportero trampa de genes primaria (Balciuniene et al. En preparación). Al igual que en agosto, menos mRFP en GBT-R15, el sitio de inicio de la traducción fue retirado de Gal4-VP16. Para la detección directa de eventos de trampa de genes, nuestros vectores contienen un reportero EGFP bajo el control de 14x Gal4 UAS 17,18. Varias características adicionales se han diseñado en nuestra bipartito trampa de genes del vector. Los UAS casete eGFP está flanqueado por sitios FRT directos (chevrons grises en la Figura 1). La inyección de la recombinasa Flp mRNA lleva a la escisión de los UAS: Casete eGFP, dejando a la mutación de genes trampa desmarcado por eGFP fluorescencia. Entonces puede ser utilizado en las líneas transgénicas que marcan los tejidos específicos o eventos de desarrollo de la fluorescencia de GFP. Al igual que en otraGBTS, todo el casete de trampa de genes está flanqueado por sitios loxP directos (pentágonos abiertos en la Figura 1). Esto hace que los eventos de genes trampa reversible mediante la expresión de la recombinasa Cre, se establece fácilmente una prueba de relación de causalidad entre una integración específica de trampa de genes y fenotipo observado (Figura 2). Finalmente, la casete de trampa de genes está flanqueado por sitios de meganucleasa I-SceI invertidas (triángulos negros en la Figura 1). En Drosophila, integraciones transposón a menudo se convierten a deleciones (deficiencias) por escisión imprecisa del elemento P. No hay evidencia de que la escisión del transposón Tol2 (o cualquier otro transposón activo en los vertebrados, como la Bella Durmiente, PiggyBac o Ac / Ds) puede dar lugar a supresiones. Por lo tanto, se incluyeron sitios de I-SceI como un método sustituto potencial para la inducción de deleciones, a pesar de que no hay evidencia de que la I-SceI puede inducir deleciones en el pez cebra. Cabe señalar que mientras que la I-SceI Meganucleasa se ​​puede utilizar para facilitar la transgénesis en el pez cebra, la escisión de ADN por meganucleasa I-SCE se usa para estudiar los mecanismos de reparación del ADN, incluyendo propenso a errores de extremos no homólogos de unión, en la levadura y células de mamíferos 19-22. La integración de nuestra trampa gen vector puede dar lugar a la expresión de eGFP por dos mecanismos diferentes. El primero es un verdadero acontecimiento trampa de genes (Figura 1 C): el vector se integra en un gen (IMG para insertionally gen mutado), una transcripción de la fusión entre el 5 &#39;del transcrito endógeno IMG y la Gal4-VP16 se hace y se tradujo en una proteína de fusión que contiene el N-terminal de la proteína codificada por IMG y Gal4-VP16. Esta proteína de fusión se une a los 14x UAS y activa la transcripción de EGFP. El segundo evento, menos deseable es un potenciador trampa (Figura 1D): el promotor mínimo delante de eGFP cae bajo el control de un promotor de cerca del sitio de integración, que conduce a la producción de EGFP en el ABsencia de producción Gal4-VP16. En nuestra estimación, el 30-50% de los eventos EGFP expresión se deben a una trampa potenciador y un 50-70% se debe a una trampa gen 23 (Balciuniene et al., En preparación). Para distinguir entre estas dos clases de eventos, hemos hecho una 14xUAS: mRFP línea transgénica (Figura 1B), por conveniencia marcada por la lente específica γCry: (. Balciuniene et al, en preparación) GFP. Eventos trampa de genes se verifican por la co-expresión de GFP y RFP (comparar C y D en la Figura 2). En la pantalla de nuestro piloto, hemos recuperado más de 40 eventos de genes trampa después de cribado 270 F0 peces inyectados con una mezcla de ADN transposón y mRNA transposasa. Dos de nuestras integraciones genes trampa se han producido en los genes con los publicados anteriormente mutantes inducidos químicamente: NSF y la RPF. Los fenotipos de los mutantes de inserción nuestra tpl6 nsf y tpl24 flr son superficialmente indistinguible del fenotipos de los correspondientes mutantes inducidos químicamente. También tomamos nota de que los acontecimientos de genes trampa aparecen sesgados hacia los intrones cerca del extremo 5 &#39;de los genes, lo que aumenta la probabilidad de alelos nulos. Hacemos observar algún grado de UAS silenciamiento (variegación) en todas nuestras líneas de genes trampa, y algunos loci son claramente más susceptibles al abigarramiento que otros. No creemos que la UAS silenciamiento es un problema importante para la propagación de las líneas de genes trampa, ya que hemos sido capaces de propagarse fácilmente todas nuestras líneas de trampa de genes a través de al menos cinco generaciones mediante la selección de la expresión de GFP sola.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

Tamaño de la nidada grande exterior y el desarrollo de los embriones ópticamente transparentes hacen que el pez cebra un modelo de sistema de vertebrados excepcional para in vivo mediante mutagénesis de inserción reporteros fluorescentes para etiquetar la expresión de los genes mutados. Varios laboratorios han construido y probado vectores potenciador-y gen-trampa en el pez cebra, el uso de proteínas fluorescentes, activadores transcripcionales basados ​​en lexA Gal4-y como reporteros 1-7. Estos vectores tienen dos inconvenientes potenciales: rigurosidad subóptima (por ejemplo, la falta de capacidad para diferenciar entre eventos potenciador-y gen-trampa) y bajo la mutagenicidad (por ejemplo, las integraciones en genes raramente producidos alelos nulos). Gene Breaking Transposón (GBTS) fueron desarrollados para hacer frente a estos inconvenientes 8-10. Hemos modificado uno de los primeros vectores GBT, GBT-R15, para uso con Gal4-VP16 como el reportero trampa de genes primaria y UAS añadido: eGFP como el reportero secundaria para la detección directa de eventos de genes trampa. Laplicación de Gal4-VP16 como la trampa del gen indicador primario proporciona dos ventajas principales. En primer lugar, aumenta la sensibilidad de los genes expresados ​​en los niveles de expresión bajos. En segundo lugar, permite a los investigadores utilizar líneas de trampas génicas como conductores Gal4 a la expresión directa de otros transgenes en los tejidos muy específicos. Esto es especialmente pertinente para los genes con funciones no esenciales o redundantes, donde la integración trampa de genes puede no dar lugar a fenotipos manifiestos. La desventaja de usar Gal4-VP16 como la trampa de genes reportero primaria es que los genes que codifican para proteínas con secuencias de señal N-terminal no son susceptibles de atrapar, como son poco probable que sea capaz de entrar en el núcleo de las proteínas de fusión de Gal4-VP16 resultantes y activan la transcripción. Es importante destacar que el uso de Gal4-VP16 no preseleccionar para las proteínas nucleares: recuperamos mutaciones de genes trampa en los genes que codifican las proteínas que funcionan en el núcleo, el citoplasma y la membrana plasmática.

En una inyección de éxito, al menos 80% de los embriones inyectados con la trampa de genes de ADN / Tol2 transposasa mezcla ARNm mostrar un cierto grado de fluorescencia de GFP (Figura 3). Cuando se seleccionan las más brillantes embriones GFP-positivas (Figura 3C) para establecer la piscina F0, aproximadamente uno de cada 10 peces examinados F0 rendirá gen trampa progenie. Entre los peces F0 de la que se recuperan eventos de trampa de genes, más transmitir un único evento de trampa de genes, además de varias integraciones transposón no expresan. Sin embargo, hemos establecido hasta cuatro líneas de genes trampa de un solo individuo F0. Los patrones de expresión de GFP / RFP en líneas de trampa de genes van desde muy específico de tejido (por ejemplo, en bulbos olfativos) a bastante ubicua. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Figura 1. Tque contiene GAL4-bipartita vector de trampa de genes-GBT B1 y sus aplicaciones. A. Componentes de la trampa de genes del vector Gal4-que contiene: Tol2 5 &#39;y Tol2 3&#39;, minimal transposón Tol2 termina 13; CSA, Carpa β-actina aceptor de empalme 8; ^ Gal4-VP16, agosto-Gal4-VP16 menos; zp ( A), β-actina UTR y poli pez cebra 3 &#39;(A) elementos de GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP y SV40 p (A) son componentes de la UAS: caja de expresión eGFP 17,18. La flecha indica la activación de la UAS: eGFP por Gal4-VP16 producido por la trampa de genes B. El 14XUAS:. MRFP transgén marcado por una γCry-lente específica: Casete GFP. La flecha indica la activación de la UAS: mRFP por Gal4-VP16 en trans evento trampa C. Gene.. Cajas azules son exones. El empalme se indica por la línea de trazos. Evento trampa D. Enhancer. La integración del vector cerca de un promotor (caja marrón) puede colocar el promotor mínimo EGFP bajo el control de este potenciador (flecha marrón). Esto daría lugar a una expresión específica de tejido de eGFP, pero desde Gal4-VP16 no se hace, la expresión mRFP no estaría activado. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Figura 2. Reversión de los acontecimientos de genes trampa utilizando la recombinasa Cre. A, B. Diagrama de una mutación trampa de genes (A) y vuelto-Cre trampa de genes alelo (B). C, D. Co-expresión de GFP (C) y RFP (D) en el sistema nervioso del gen tpl6 NSF línea de trampas. E, F. La inyección de Cre ARN en embriones tpl6 nsf conduce a la pérdida de las buenas prácticas agrarias (E) y RFP expresión (F). Tenga en cuenta que no hay una reducción de la expresión de GFP en la lente, como se esperaba. Figura 3. Los embriones inyectados con el GBT-B1 (pDB783) trampa de genes. . A. Los embriones inyectados con pGBT-B1 (pDB783) pantalla solo poca fluorescencia de GFP en el cuerpo B, C. Los embriones inyectados con pGBT-B1 y Tol2 mRNA transposasa: un grupo aleatorio de embriones (B) y de alta expresores seleccionados para la cría (C). <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Figura 4. Esquema experimental para el establecimiento de líneas Gal4 trampa de genes. Estructuras rojas / verde Parcialmente superpuestos indican co-expresión de las buenas prácticas agrarias y RFP, mientras que el verde por sí solo indica mosaicismo para eventos de genes trampa o potenciador trampa.

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Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Este protocolo describe el método de trampa de genes inserción mutagénesis usando Gal4-VP16 como el reportero principal y GFP / RFP como reporteros secundarias en el pez cebra. Aproximadamente uno de cada diez-alta expresión de genes rendimiento pesquero F0 trampa progenie co-expresión de las buenas prácticas agrarias y RFP. El procedimiento de detección se puede escalar fácilmente para adaptarse al tamaño de la pantalla de laboratorio que realice la mutagénesis de inserción.

Gene reventado Usando Gal4 en pez cebra

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K vistas.  Temple University.  Este protocolo describe el método de trampa de genes inserción mutagénesis usando Gal4-VP16 como el reportero principal y GFP / RFP como reporteros secundarias en el pez cebra. Aproximadamente uno de cada diez-alta expresión de genes rendimiento pesquero F0 trampa progenie co-expresión de las buenas prácticas agrarias y RFP. El procedimiento de detección se puede escalar fácilmente para adaptarse al tamaño de la pantalla de laboratorio que realice la mutagénesi...

Video: Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Investigación

Biología

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Gene mundial y Análisis de Expresión utilizando una plataforma de microarrays de oligonucleótidos de pez cebra

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Inducción y prueba de hipoxia en el cultivo celular

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavage adultos de pez cebra

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...