Damos las gracias a la Dra. Jennifer Emtage para la lectura crítica del manuscrito, Ryan Gill para la asistencia técnica y ayuda con el cuidado de pez cebra y el Dr. Stephen C. Ekker (Clínica Mayo, Rochster, Minnesota) para los reactivos. Nuestro trabajo ha sido apoyado por Temple University College de Ciencia y Tecnología y el Instituto Nacional de Salud (R01-HD061749).

1. La producción de la generación F0 por microinyección de la Trampa de Gene. Hemos encontrado que los embriones de diferentes orígenes genéticos muestran diferentes tolerancias a este procedimiento, con el tipo salvaje basado pet-store-and Tubinga - Long Fin (TLF) el más tolerante mientras que las cepas AB y Tubinga tienen peor supervivencia. <ol><li> Preparación de ADN transposón. Preparar GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al., En preparación) ADN plásmido utilizando el kit QIAprep miniprep estándar (Qiagen 27106). Es esencial incluir la etapa de lavado PB (que es opcional en el procedimiento QIAprep), de lo contrario el ADN miniprep se contaminará por la RNasa A, que conduce a la degradación del ARNm de la transposasa. Antes de la inyección, se diluye la DNA en agua libre de RNasa (Ambion AM9937) a 10 ng / l. </li><li> Preparación de ARNm de transposasa. Linealizar pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 utilizando XbaI y transcribir el ADN linearizado utilizando una máquina T3 mMessage(Ambion AM1348) en el kit de transcripción in vitro. Hemos modificado la reacción de transcripción in vitro por la adición de 0,5 l de inhibidor de RNasa RiboLock (ThermoFisher Fermentas EO0381). Después de la etapa de tratamiento DNasa, purificar mRNA utilizando un kit RNeasy MinElute (Qiagen 74204). Evaluar la calidad de la vitro ARNm transcrito por electroforesis en gel de agarosa. Diluir el mRNA en RNasa libre de agua a 40 ng / l, y almacena como 2 alícuotas a -80 ° C. </li><li> Preparación de la mezcla de microinyección. Antes de la inyección, añada 8 l de ADN transposón diluido a una alícuota de 2 l de mRNA transposasa. </li><li> La microinyección. Inyectar 3 nl de mezcla de ADN / ARN en la yema de 1 embriones de pez cebra celular utilizando técnicas de microinyección estándar, con el objetivo para el interfaz yema / blastómeros. Recoger los embriones cada 20 minutos para asegurar la inyección en la etapa celular 1. En nuestra experiencia, una persona hábil puede inyectar fácilmente 1.000 embriones en 1-1.5 horas. </li><li> Después de la inyección, ejecute 5 l de izquierdamás de la solución de inyección en un gel de agarosa al 1% para el control de calidad, para asegurar que el ARNm de la transposasa no se ha degradado. </li><li> Cuidado embrión inyectado. En la tarde, eliminar embriones fecundados y anormales y distribuir embriones de 60 a 80 por cada 100 mm placa de Petri. Embriones anormales y muertas se eliminan después de la fecundación en 1 día (dpf), 2 dpf y 3 dpf. </li><li> La detección de la expresión de GFP. Embriones pantalla sin defectos manifiestos de la fluorescencia de GFP en 3 fdd (Figura 3). La detección puede hacerse ya sea en un microscopio estereoscópico equipado con fluorescencia (Nikon usamos un SMZ1500) o en un microscopio vertical (usamos un Zeiss AxioImager con un objetivo de 5X Fluar). Bajo la expresión de GFP indica la inyección sin éxito o la degradación de ARN transposasa debido a la contaminación de RNasa (Figura 3A). Seleccionar aproximadamente el 30% de los embriones más brillantes que, o bien tienen la expresión de GFP en varios tejidos o en un alto porcentaje de células de un tejido específico (comparar Figuras 3B y 3C). Desde una inyección de 1.000 embriones, por lo general tienen un máximo de 100 altas que expresan GFP embriones de desarrollo normales,. </li><li> Levante embriones F0 seleccionados mediante procedimientos de cría de peces cebra normales. Es razonable esperar que el 20-30% de los embriones inyectados seleccionados para la cría va a sobrevivir hasta la edad adulta. </li></ol> 2. Mantenimiento de los UAS: mRFP Tester Line. Hemos generado un 14xUAS: Línea mRFP marcado por γCry-lente específica: las buenas prácticas agrarias. Desde UAS está sujeta a silenciar a través de la metilación del ADN, es importante seleccionar el pescado con niveles bajos de silenciamiento para propagar la acción. <ol><li> Configure UAS individuo: homocigotos mRFP para aparearse con uno de nuestros más confiables Gal4 trampa líneas gene, tpl6 nsf (Balciuniene y otros en preparación.). </li><li> En el día siguiente, transferir la UAS: peces mRFP que dieron los embriones a los tanques estáticos individuales, mientras que se recogen los embrionesy limpiado. </li><li> Embriones de malla para las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia a 1 dpf y 3 dpf. </li><li> Peces Intercross que dio embriones con alta expresión mRFP para establecer la próxima generación de UAS: Línea mRFP. </li></ol> 3. Proyección de la F0 Fish. <ol><li> Cruce F0 individual con la UAS homocigotos: peces mRFP (Figura 4). Por lo general, inyectamos nuestros GBTS en líneas con patrones de tipo salvaje o de pigmentación de leopardo, y nuestros UAS homocigotos: Línea mRFP es en latón. Por lo tanto los peces inyectados F0-GBT puede diferenciarse fácilmente de los UAS: peces mRFP, eliminando la necesidad de registrar si el F0 estar estudiadas era un hombre o una mujer, así como los posibles errores resultantes de errores en el registro y / o que determinan el sexo de cada pez. Por lo tanto, personal con experiencia muy limitada, tales somos estudiantes universitarios, son capaces de crear y romper los apareamientos de pescado. Este enfoque tiene la desventaja de que dos fondos genéticos diferentes sonsiendo utilizado, complicando potencialmente la interpretación de la pérdida de función de fenotipos. </li><li> Al día siguiente, devolver los UAS de latón: peces mRFP a su tanque. Coloque el pescado F0 que dio embriones en tanques estáticos individuales (usamos Hagen Exo Terra Faunarium Pequeño, pero cualquier pequeño tanque se puede utilizar para este propósito), mientras que los embriones son recogidos y examinados. </li><li> Limpie y transferencia de embriones recolectados en nuevas placas de Petri (&lt;100 por placa) en la tarde del día 0. </li><li> Embriones de malla para las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia a 1 dpf, 2 y 3 fdd fdd. Tire de embriones positivos tanto para las buenas prácticas agrarias y RFP, ordenarlas por patrón de expresión de GFP / RFP (si más de un patrón se observa en un embrague) y criarlos para establecer la generación F1. </li><li> La eutanasia a los peces F0 que produjo sólo los embriones negativos (de un total de 50 a 100 embriones). </li><li> Cruce el pescado F0 que produjo GFP / progenie RFP-positivo de nuevo para obtener una segunda tanda de positivos. </li></ol> 4.Proyección de la F1 Fish. El pescado F1 son examinados para establecer familias F2, para documentar el patrón de expresión de genes y la trampa para congelar lotes de embriones para la identificación molecular de trampa de genes loci por 5 &#39;RACE y PCR inversa. <ol><li> Cruce de pescado individual F1 con la UAS homocigotos: peces mRFP (Figura 4). </li><li> Al día siguiente, coloque el pescado F1 que le dio a los embriones en tanques estáticos individuales, mientras que los embriones son recogidos y examinados. </li><li> Embriones de malla para las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia a 1 dpf, 2 y 3 fdd fdd. Embriones separados y fotografiar positivos tanto para las buenas prácticas agrarias y RFP 24. </li><li> A las 5 dpf, congelar lotes de 20 GFP / RFP-positivo y 20 GFP / embriones-RFP negativo para la identificación de genes mutados insertionally mediante PCR inversa y 5 &#39;RACE 9,10. Levante restantes GFP / embriones RFP-positivas para establecer la generación F2. </li></ol>

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Estos autores no tienen nada que revelar.

Los vectores de genes trampa y la metodología descritos aquí ya están siendo utilizados en varios laboratorios independientes. En nuestra experiencia, hay dos pasos fundamentales en el proceso. El primer paso fundamental es lograr altos índices de integración trampa de genes en embriones inyectados F0. El fracaso en este paso a menudo se puede atribuir a la contaminación de RNasa de los reactivos de inyección, especialmente el ADN miniprep. También es muy importante para inyectar embriones en la etapa de 1 célula para atrapar gen experimentos. En nuestra experiencia, la transgénesis mediada por Tol2 es muy eficiente, por lo que es posible la obtención de líneas transgénicas incluso cuando se inyecta más tarde de la etapa 1 con el ADN celular o de menor calidad. Inyecciones de baja calidad es mucho más problemática cuando se lleva a cabo mutagénesis de trampa de genes, ya que sólo una pequeña fracción de las integraciones vector resulta en eventos efectivos de genes trampa. El segundo paso crítico es determinar los eventos de trampa de genes cruzando a nuestro UAS: Línea mRFP. Ausencia de expresión mRFP escasi siempre indicativa de un evento potenciador trampa. Sin embargo, a veces la falta de expresión mRFP puede indicar el silenciamiento de los 14x UAS. Por tanto, es importante mantener los UAS: Línea mRFP en un estado no silenciada mediante la propagación de la próxima generación utilizando individuos con alta expresión de RFP cuando se cruzan a tpl6 nsf. Podemos prever hacer una serie de mejoras a nuestros vectores de genes trampa y protocolo. El primero es el uso de un UAS menos repetitivas en la trampa de genes constructo. Se ha demostrado que una 5x UAS es suficiente para lograr la activación completa en experimentos de cultivo de células, y que las secuencias UAS menos repetitivas son menos susceptibles a la metilación y el silenciamiento de 6,25. También puede ser posible diseñar vectores trampa de genes para la mutagénesis totalmente condicional, en analogía a los vectores utilizados por el ratón trampa de genes consorcio internacional y recientemente adaptados para el pez cebra 2,26,27. Otra mejora sería utilizar un t diferentesistema ransposon, por ejemplo la bella durmiente 28, para generar un UAS: Línea reportero mRFP. Esto permitiría la inyección de trampas de genes basados ​​en Tol2 directamente en la línea de reportero y el cribado de F0s por incrossing. Además, esto eliminaría el uso de dos fondos genéticos diferentes, por lo que la interpretación de la pérdida de función de los fenotipos más sencillo. Incluso con estas mejoras, el Gal4 trampa de genes protocolo general que se presenta aquí seguiría siendo plenamente aplicables.

Mutagénesis insercional ha demostrado ser un enfoque poderoso para la disección de la función de genes en diversos sistemas modelo a partir de organismos unicelulares como las bacterias y levaduras para los organismos multicelulares tales como los ratones y las plantas. Cualquier ADN exógeno (virus, plásmido o transposón) puede servir como un mutágeno mediante la interrupción de los elementos esenciales de los genes tales como exones o promotores. El objetivo efectivo de tales enfoques simples es extremadamente pequeña en grandes genomas complejos, ya que los exones representan sólo el 1-3% de un genoma típico de los vertebrados. Tamaño de destino efectivo pequeño puede ser superada por las tasas de integración muy alto por vectores, como lo demuestra el tremendo éxito de la mutagénesis de inserción retroviral en el pez cebra 11,12. Por el contrario, los intrones comprenden aproximadamente el 20-30% de los genomas de vertebrados. En el pez cebra, vectores de mutagénesis de inserción basado en transposón que introducen efectivamente nulo o hypomorphic mutaciones severas sobre la integración en los intrones se han llamado &quot;gen romper transposons &quot;(GBTS) 8-10. Para la integración eficiente trampa de genes, que utilizan un transposón mínima Tol2 13,14. Mutagenicidad de GBTS se basa en peces derivados de aceptor de empalme y secuencias de terminación / poliadenilación de la transcripción. Los elementos responsables de GBT mutagenicidad están flanqueadas por sitios loxP directos para la escisión por la recombinasa Cre. Por lo tanto, la inyección de ARNm de Cre conduce a la reversión eficiente de mutaciones inducidas por GBT, a pesar de que algunas secuencias de transposones permanecen en el locus de integración de 9,10. Los vectores GBT recientemente publicados utilizan mRFP como el reportero 9,10 trampa de genes, dando lugar a dos posibles deficiencias. En primer lugar, no se sabe qué fracción de los genes de pez cebra se expresa a un nivel lo suficientemente alto para ser detectados por las proteínas de fusión reportero directos fluorescentes. En segundo lugar, se espera que sólo un pequeño subconjunto de los genes que tienen funciones esenciales. Se ha estimado que sólo hay 1,400-2,400 genes necesarios para desarroll pez cebrant 15,16. No se espera que la mayoría de los mutantes de genes trampa para mostrar fenotipos abiertas y por lo tanto tendrá una utilidad limitada. Para superar estas dos limitaciones, hemos modificado GBT-R15 9,10 a utilizar con Gal4-VP16 como el reportero trampa de genes primaria (Balciuniene et al. En preparación). Al igual que en agosto, menos mRFP en GBT-R15, el sitio de inicio de la traducción fue retirado de Gal4-VP16. Para la detección directa de eventos de trampa de genes, nuestros vectores contienen un reportero EGFP bajo el control de 14x Gal4 UAS 17,18. Varias características adicionales se han diseñado en nuestra bipartito trampa de genes del vector. Los UAS casete eGFP está flanqueado por sitios FRT directos (chevrons grises en la Figura 1). La inyección de la recombinasa Flp mRNA lleva a la escisión de los UAS: Casete eGFP, dejando a la mutación de genes trampa desmarcado por eGFP fluorescencia. Entonces puede ser utilizado en las líneas transgénicas que marcan los tejidos específicos o eventos de desarrollo de la fluorescencia de GFP. Al igual que en otraGBTS, todo el casete de trampa de genes está flanqueado por sitios loxP directos (pentágonos abiertos en la Figura 1). Esto hace que los eventos de genes trampa reversible mediante la expresión de la recombinasa Cre, se establece fácilmente una prueba de relación de causalidad entre una integración específica de trampa de genes y fenotipo observado (Figura 2). Finalmente, la casete de trampa de genes está flanqueado por sitios de meganucleasa I-SceI invertidas (triángulos negros en la Figura 1). En Drosophila, integraciones transposón a menudo se convierten a deleciones (deficiencias) por escisión imprecisa del elemento P. No hay evidencia de que la escisión del transposón Tol2 (o cualquier otro transposón activo en los vertebrados, como la Bella Durmiente, PiggyBac o Ac / Ds) puede dar lugar a supresiones. Por lo tanto, se incluyeron sitios de I-SceI como un método sustituto potencial para la inducción de deleciones, a pesar de que no hay evidencia de que la I-SceI puede inducir deleciones en el pez cebra. Cabe señalar que mientras que la I-SceI Meganucleasa se ​​puede utilizar para facilitar la transgénesis en el pez cebra, la escisión de ADN por meganucleasa I-SCE se usa para estudiar los mecanismos de reparación del ADN, incluyendo propenso a errores de extremos no homólogos de unión, en la levadura y células de mamíferos 19-22. La integración de nuestra trampa gen vector puede dar lugar a la expresión de eGFP por dos mecanismos diferentes. El primero es un verdadero acontecimiento trampa de genes (Figura 1 C): el vector se integra en un gen (IMG para insertionally gen mutado), una transcripción de la fusión entre el 5 &#39;del transcrito endógeno IMG y la Gal4-VP16 se hace y se tradujo en una proteína de fusión que contiene el N-terminal de la proteína codificada por IMG y Gal4-VP16. Esta proteína de fusión se une a los 14x UAS y activa la transcripción de EGFP. El segundo evento, menos deseable es un potenciador trampa (Figura 1D): el promotor mínimo delante de eGFP cae bajo el control de un promotor de cerca del sitio de integración, que conduce a la producción de EGFP en el ABsencia de producción Gal4-VP16. En nuestra estimación, el 30-50% de los eventos EGFP expresión se deben a una trampa potenciador y un 50-70% se debe a una trampa gen 23 (Balciuniene et al., En preparación). Para distinguir entre estas dos clases de eventos, hemos hecho una 14xUAS: mRFP línea transgénica (Figura 1B), por conveniencia marcada por la lente específica γCry: (. Balciuniene et al, en preparación) GFP. Eventos trampa de genes se verifican por la co-expresión de GFP y RFP (comparar C y D en la Figura 2). En la pantalla de nuestro piloto, hemos recuperado más de 40 eventos de genes trampa después de cribado 270 F0 peces inyectados con una mezcla de ADN transposón y mRNA transposasa. Dos de nuestras integraciones genes trampa se han producido en los genes con los publicados anteriormente mutantes inducidos químicamente: NSF y la RPF. Los fenotipos de los mutantes de inserción nuestra tpl6 nsf y tpl24 flr son superficialmente indistinguible del fenotipos de los correspondientes mutantes inducidos químicamente. También tomamos nota de que los acontecimientos de genes trampa aparecen sesgados hacia los intrones cerca del extremo 5 &#39;de los genes, lo que aumenta la probabilidad de alelos nulos. Hacemos observar algún grado de UAS silenciamiento (variegación) en todas nuestras líneas de genes trampa, y algunos loci son claramente más susceptibles al abigarramiento que otros. No creemos que la UAS silenciamiento es un problema importante para la propagación de las líneas de genes trampa, ya que hemos sido capaces de propagarse fácilmente todas nuestras líneas de trampa de genes a través de al menos cinco generaciones mediante la selección de la expresión de GFP sola.

<table><tbody><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Optional PB wash step is a must</td></tr><tr><td>XbaI restriction enzyme</td><td>ThermoFisher</td><td>ER0681</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Machine T3</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl!</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Has to be non-DEPC treated</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcapiliaries for calibration</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller *</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope for microinjection * </td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand</td></tr><tr><td>Picoinjector *</td><td>Harvard Instruments</td><td>Pli-90</td><td>We also use Pli-100</td></tr><tr><td>Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioImager</td><td>5X Fluar objective has sufficient working distance</td></tr><tr><td>Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td></tr></tbody></table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

Tamaño de la nidada grande exterior y el desarrollo de los embriones ópticamente transparentes hacen que el pez cebra un modelo de sistema de vertebrados excepcional para in vivo mediante mutagénesis de inserción reporteros fluorescentes para etiquetar la expresión de los genes mutados. Varios laboratorios han construido y probado vectores potenciador-y gen-trampa en el pez cebra, el uso de proteínas fluorescentes, activadores transcripcionales basados ​​en lexA Gal4-y como reporteros 1-7. Estos vectores tienen dos inconvenientes potenciales: rigurosidad subóptima (por ejemplo, la falta de capacidad para diferenciar entre eventos potenciador-y gen-trampa) y bajo la mutagenicidad (por ejemplo, las integraciones en genes raramente producidos alelos nulos). Gene Breaking Transposón (GBTS) fueron desarrollados para hacer frente a estos inconvenientes 8-10. Hemos modificado uno de los primeros vectores GBT, GBT-R15, para uso con Gal4-VP16 como el reportero trampa de genes primaria y UAS añadido: eGFP como el reportero secundaria para la detección directa de eventos de genes trampa. Laplicación de Gal4-VP16 como la trampa del gen indicador primario proporciona dos ventajas principales. En primer lugar, aumenta la sensibilidad de los genes expresados ​​en los niveles de expresión bajos. En segundo lugar, permite a los investigadores utilizar líneas de trampas génicas como conductores Gal4 a la expresión directa de otros transgenes en los tejidos muy específicos. Esto es especialmente pertinente para los genes con funciones no esenciales o redundantes, donde la integración trampa de genes puede no dar lugar a fenotipos manifiestos. La desventaja de usar Gal4-VP16 como la trampa de genes reportero primaria es que los genes que codifican para proteínas con secuencias de señal N-terminal no son susceptibles de atrapar, como son poco probable que sea capaz de entrar en el núcleo de las proteínas de fusión de Gal4-VP16 resultantes y activan la transcripción. Es importante destacar que el uso de Gal4-VP16 no preseleccionar para las proteínas nucleares: recuperamos mutaciones de genes trampa en los genes que codifican las proteínas que funcionan en el núcleo, el citoplasma y la membrana plasmática.

En una inyección de éxito, al menos 80% de los embriones inyectados con la trampa de genes de ADN / Tol2 transposasa mezcla ARNm mostrar un cierto grado de fluorescencia de GFP (Figura 3). Cuando se seleccionan las más brillantes embriones GFP-positivas (Figura 3C) para establecer la piscina F0, aproximadamente uno de cada 10 peces examinados F0 rendirá gen trampa progenie. Entre los peces F0 de la que se recuperan eventos de trampa de genes, más transmitir un único evento de trampa de genes, además de varias integraciones transposón no expresan. Sin embargo, hemos establecido hasta cuatro líneas de genes trampa de un solo individuo F0. Los patrones de expresión de GFP / RFP en líneas de trampa de genes van desde muy específico de tejido (por ejemplo, en bulbos olfativos) a bastante ubicua. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Figura 1. Tque contiene GAL4-bipartita vector de trampa de genes-GBT B1 y sus aplicaciones. A. Componentes de la trampa de genes del vector Gal4-que contiene: Tol2 5 &#39;y Tol2 3&#39;, minimal transposón Tol2 termina 13; CSA, Carpa β-actina aceptor de empalme 8; ^ Gal4-VP16, agosto-Gal4-VP16 menos; zp ( A), β-actina UTR y poli pez cebra 3 &#39;(A) elementos de GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP y SV40 p (A) son componentes de la UAS: caja de expresión eGFP 17,18. La flecha indica la activación de la UAS: eGFP por Gal4-VP16 producido por la trampa de genes B. El 14XUAS:. MRFP transgén marcado por una γCry-lente específica: Casete GFP. La flecha indica la activación de la UAS: mRFP por Gal4-VP16 en trans evento trampa C. Gene.. Cajas azules son exones. El empalme se indica por la línea de trazos. Evento trampa D. Enhancer. La integración del vector cerca de un promotor (caja marrón) puede colocar el promotor mínimo EGFP bajo el control de este potenciador (flecha marrón). Esto daría lugar a una expresión específica de tejido de eGFP, pero desde Gal4-VP16 no se hace, la expresión mRFP no estaría activado. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Figura 2. Reversión de los acontecimientos de genes trampa utilizando la recombinasa Cre. A, B. Diagrama de una mutación trampa de genes (A) y vuelto-Cre trampa de genes alelo (B). C, D. Co-expresión de GFP (C) y RFP (D) en el sistema nervioso del gen tpl6 NSF línea de trampas. E, F. La inyección de Cre ARN en embriones tpl6 nsf conduce a la pérdida de las buenas prácticas agrarias (E) y RFP expresión (F). Tenga en cuenta que no hay una reducción de la expresión de GFP en la lente, como se esperaba. Figura 3. Los embriones inyectados con el GBT-B1 (pDB783) trampa de genes. . A. Los embriones inyectados con pGBT-B1 (pDB783) pantalla solo poca fluorescencia de GFP en el cuerpo B, C. Los embriones inyectados con pGBT-B1 y Tol2 mRNA transposasa: un grupo aleatorio de embriones (B) y de alta expresores seleccionados para la cría (C). <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Figura 4. Esquema experimental para el establecimiento de líneas Gal4 trampa de genes. Estructuras rojas / verde Parcialmente superpuestos indican co-expresión de las buenas prácticas agrarias y RFP, mientras que el verde por sí solo indica mosaicismo para eventos de genes trampa o potenciador trampa.

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Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Este protocolo describe el método de trampa de genes inserción mutagénesis usando Gal4-VP16 como el reportero principal y GFP / RFP como reporteros secundarias en el pez cebra. Aproximadamente uno de cada diez-alta expresión de genes rendimiento pesquero F0 trampa progenie co-expresión de las buenas prácticas agrarias y RFP. El procedimiento de detección se puede escalar fácilmente para adaptarse al tamaño de la pantalla de laboratorio que realice la mutagénesis de inserción.

Gene reventado Usando Gal4 en pez cebra

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K vistas.  Temple University.  Este protocolo describe el método de trampa de genes inserción mutagénesis usando Gal4-VP16 como el reportero principal y GFP / RFP como reporteros secundarias en el pez cebra. Aproximadamente uno de cada diez-alta expresión de genes rendimiento pesquero F0 trampa progenie co-expresión de las buenas prácticas agrarias y RFP. El procedimiento de detección se puede escalar fácilmente para adaptarse al tamaño de la pantalla de laboratorio que realice la mutagénesi...

Video: Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Imágenes en vivo de inmune innata y preneoplásicas Interacciones de celda que utilizan un sistema de expresión / UAS Inducible Gal4 en larvas de pez cebra de la piel

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Genética

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Neurociencias

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biología

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

<meta charset="utf8"></head><body>Marcaje de proteínas fluorescentes en larvas de pez cebra mediante CRISPR/Cas9 knock-in

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Gene reventado Usando Gal4 en pez cebra

Resumen

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Capítulos en este video

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El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

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Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra

Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra