Nuestro método hace posible las investigaciones subcelulares mecanicistas en el campo de la mecanobiología, que se mueve rápidamente, fijando las modificaciones temporales de las proteínas en su lugar y luego detectándolas con anticuerpos específicos. Este método es técnicamente fácil de aplicar. Los resultados son altamente válidos y reproducibles.
Además, en comparación con otras técnicas, nuestro método podría utilizarse de forma eficaz en el campo emergente de la señalización postraduccional de los glóbulos rojos, que depende de modificaciones proteicas temporales, especialmente la mecanoseñalización de los glóbulos rojos. Para realizar la fijación de proteínas de glóbulos rojos, diluya la sangre entera en una proporción de uno a dos en una solución de paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar la solución sanguínea a 132 g durante tres minutos a temperatura ambiente y retirar con cuidado el sobrenadante.
Vuelva a suspender el gránulo de glóbulos rojos en dos volúmenes de PBS 0,1 molar e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Nuevamente, centrifugue la muestra y retire el sobrenadante antes de volver a suspender el gránulo de glóbulos rojos en un volumen de PBS 0.1 molar. Etiquete un portaobjetos de microscopio con la identificación de la muestra y el anticuerpo aplicado con una pluma resistente al alcohol.
Agregue 10 microlitros de la solución de glóbulos rojos preparada. Coloque un segundo portaobjetos sobre la muestra en un ángulo de 45 grados y disperse la muestra uniformemente a lo largo del portaobjetos. Fije el portaobjetos con calor colocando la muestra sobre el quemador Bunsen con un movimiento constante durante cinco a siete segundos.
Para la tinción inmunohistoquímica, marque el área de 2/3 del portaobjetos como prueba y 1/3 como control con un lápiz graso. A continuación, lave las áreas de muestra dos veces aplicando TBS durante 30 segundos. Después del segundo lavado, agregue 0,1% de tripsina y cubra el portaobjetos con una cámara de incubación especialmente diseñada con tapa.
Incubar la muestra durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Llene un vaso de precipitados con agua del grifo y detenga la reacción enzimática agregando el agua del grifo del vaso de precipitados al portaobjetos. Vierta la solución y lave ambas áreas tres veces con TBS.
Después del lavado final, agregue la solución bloqueadora de peroxidasa e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, vierta la solución y lave ambas áreas tres veces con TBS. Luego agregue una solución de leche descremada al 3% e incube durante 30 minutos.
Después de la incubación, vierta la solución y agregue la solución de anticuerpos primarios al área de prueba. Agregue la solución de control de anticuerpos al área de control. Incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, vierta la solución de anticuerpos y lave ambas áreas tres veces con TBS. A continuación, añadir una solución de suero de cabra normal al 3% para evitar la unión inespecífica e incubar durante 30 minutos. Después de la incubación, agregue una solución de anticuerpos secundarios e incube durante 30 minutos.
Vierta la solución de anticuerpos y lave las áreas tres veces con TBS antes de proceder al desarrollo de la tinción. A continuación, para llevar a cabo una reacción de peroxidasa de rábano picante acoplada a avidina, agregue una solución diluida de avidina peroxidasa e incube durante 30 minutos. Coloque el portaobjetos bajo un microscopio con un aumento de 200 veces y agregue una solución DAB recién preparada en ambas áreas.
Controle la tinción de los glóbulos rojos de forma continua y detenga la tinción retirando la solución DAB con una pipeta desechable antes de que el fondo comience a colorear. Para realizar la deshidratación de la muestra, coloque el portaobjetos en una rejilla de vidrio y sumérjalo durante cinco segundos cada uno en concentraciones crecientes de etanol y, finalmente, en xilol. Después de la deshidratación, coloque el portaobjetos sobre papel de seda con los glóbulos rojos en la parte superior para absorber el exceso de líquido.
Agregue dos o tres gotas de medio de montaje en un cubreobjetos y cubra la guía con el cubreobjetos. Para la visualización y la obtención de imágenes, coloque el portaobjetos en un microscopio de luz transmitida junto con una cámara. Encienda la fuente de luz y la cámara e inicie el software.
En el modo de campo claro, enfoque los glóbulos rojos girando las perillas de ajuste de enfoque grueso y fino. Del mismo modo, enfoque los glóbulos rojos en modo fluorescente. Para analizar el valor de gris de RBC, marque el borde de cada RBC usando la herramienta de selección ovalada dentro del software ImageJ.
Con el comando Medir, mida los valores de gris de 50 glóbulos rojos de la prueba y 10 glóbulos rojos del control. Para la tinción inmunofluorescente de proteínas de glóbulos rojos, incubar la muestra con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegiéndola de la luz. Después de la incubación, vierta la solución de anticuerpos y lave el portaobjetos tres veces con TBS.
Deje el TBS en la muestra después del lavado final. Deshidrate la muestra y prepare el portaobjetos con una cubreobjetos para su evaluación microscópica como se demuestra. Encienda el microscopio y la fuente de luz fluorescente, y enfoque los glóbulos rojos en un modo de campo claro.
Capture imágenes fluorescentes y de campo claro en al menos tres áreas distintas del área de prueba del portaobjetos seleccionado al azar. Establezca el tiempo de exposición en un segundo para imágenes fluorescentes y capture una imagen. A continuación, cambie al modo de campo claro, ajuste el tiempo de exposición en Automático y capture la imagen de campo claro correspondiente.
Guarde las imágenes en formato TIFF. Capture imágenes fluorescentes y de campo claro en al menos dos áreas distintas seleccionadas al azar del área de control de la diapositiva. Guarde las imágenes en formato TIFF para conservar los valores de gris originales de los píxeles, evitar la compresión y llevar metadatos de la adquisición.
Para medir los valores de gris de los glóbulos rojos capturados, abra ImageJ. Marque cada celda con la Herramienta Selección Ovalada y analice usando el comando Medir. Resalte entre tres y cinco áreas libres de glóbulos rojos y determine los valores de gris para medir la señal de fondo.
Para realizar un análisis de datos alternativo de las imágenes capturadas, cree un comando de macro a través de la versión Fiji de ImageJ para la selección automatizada, la corrección de fondo y el análisis del valor de gris de una imagen determinada. Abra la imagen en formato TIFF para analizarla en Fiyi. A continuación, abra la fluorescencia de los glóbulos rojos.
ijm y haga clic en Ejecutar. La señal de los anticuerpos dirigidos contra la óxido nítrico sintasa de los glóbulos rojos, o NOS, fosforilados en el residuo de serina 1177 en reposo y en respuesta a la exposición a la fuerza mecánica se evaluó mediante inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Se detectó un aumento de tres veces en la señal de anticuerpos dirigidos contra RBC-NOS fosforilados en el residuo de serina 1177 en respuesta a la exposición a la fuerza mecánica de los glóbulos rojos en comparación con las respectivas células no cortadas cuando se evaluaron con el método inmunohistoquímico o inmunofluorescencia.
El usuario debe asegurarse de que el anticuerpo solo se aplique en el área de prueba. De lo contrario, la muestra no se puede analizar debido a la falta de un control. Dada la disponibilidad de una amplia variedad de anticuerpos, es posible dirigirse a muchas proteínas y procesos de señalización diferentes utilizando este método.
