Наш метод делает возможными механистические субклеточные исследования в быстро развивающейся области механобиологии, фиксируя временные модификации белков на месте, а затем обнаруживая их с помощью специфических антител. Этот метод технически прост в применении. Результаты отличаются высокой достоверностью и воспроизводимостью.
Кроме того, по сравнению с другими методами, наш метод действительно может быть эффективно использован в развивающейся области посттрансляционной передачи сигналов эритроцитов, которая зависит от временных модификаций белков, особенно механосигнализации эритроцитов. Для выполнения фиксации белка эритроцитов цельную кровь в соотношении один к двум разводят в 4%-ном растворе параформальдегида в течение 20 минут при комнатной температуре. Центрифугируют раствор крови при 132 г в течение трех минут при комнатной температуре и осторожно удаляют надосадочную жидкость.
Повторно суспендируйте гранулу эритроцитов в двух объемах 0,1 молярного PBS и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. Снова центрифугируют образец и удаляют надосадочную жидкость перед повторным суспендированием гранулы эритроцитов в одном объеме 0,1 моляра PBS. Пометьте предметное стекло микроскопа идентификатором образца и антителом, нанесенным с помощью спиртостойкой ручки.
Добавьте 10 микролитров приготовленного раствора эритроцитов. Поместите второй предметный стекло на образец под углом 45 градусов и равномерно распределите образец вдоль предметного стекла. Тепловую фиксацию предметного стекла можно при наведении образца над горелкой Бунзена постоянным движением в течение пяти-семи секунд.
Для иммуногистохимического окрашивания отметьте 2/3 области предметного стекла в качестве теста и 1/3 в качестве контрольного с помощью жирного карандаша. Затем промойте участки образца дважды, нанеся TBS на 30 секунд. После второй промывки добавьте 0,1% трипсина и накройте предметное стекло с помощью специально построенной инкубационной камеры с крышкой.
Инкубируйте образец в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Наполните стакан водопроводной водой и остановите ферментную реакцию, добавив водопроводную воду из стакана на предметное стекло. Слейте раствор и трижды промойте оба участка TBS.
После окончательной промывки добавьте раствор, блокирующий пероксидазу, и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации слейте раствор и трижды промойте оба участка TBS. Затем добавьте 3%-ный раствор обезжиренного молока и инкубируйте в течение 30 минут.
После инкубации слейте раствор и добавьте раствор первичных антител в область тестирования. Добавьте раствор для контроля антител в контрольную зону. Инкубируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.
На следующий день слейте раствор антител и трижды промойте оба участка TBS. Затем добавьте 3% раствор обычной козьей сыворотки, чтобы предотвратить неспецифическое связывание, и инкубируйте в течение 30 минут. После инкубации добавьте раствор вторичных антител и инкубируйте в течение 30 минут.
Слейте раствор антител и трижды промойте участки TBS, прежде чем приступать к развитию окрашивания. Далее для проведения авидин-связанной реакции пероксидазы хрена добавляют разбавленный раствор авидинпероксидазы и выдерживают в течение 30 минут. Поместите предметное стекло под микроскоп при 200-кратном увеличении и добавьте свежеприготовленный раствор DAB на обе области.
Постоянно контролируйте окрашивание эритроцитов и остановите окрашивание, удалив раствор DAB с помощью одноразовой пипетки до того, как фон начнет окрашиваться. Чтобы выполнить обезвоживание образца, поместите предметное стекло в стеклянную стойку и погрузите на пять секунд каждый в возрастающую концентрацию этанола и, наконец, в ксилол. После обезвоживания поместите предметное стекло на папиросную бумагу эритроцитами вверху, чтобы впитать лишнюю жидкость.
Добавьте две-три капли монтажного носителя на покровный лист и накройте затвор с помощью покровного стекла. Для визуализации и визуализации поместите предметное стекло в микроскоп проходящего света в сочетании с камерой. Включите источник света и камеру и запустите программное обеспечение.
В режиме яркого поля сфокусируйте эритроциты, поворачивая ручки грубой и точной регулировки фокусировки. Точно так же сфокусируйте эритроциты в режиме флуоресценции. Для анализа значения серого RBC отметьте край каждого RBC с помощью инструмента «Овальное выделение» в программном обеспечении ImageJ.
С помощью команды «Измерить» измерьте значения серого 50 эритроцитов из теста и 10 эритроцитов из контрольного элемента. Для иммунофлуоресцентного окрашивания белков эритроцитов инкубируют образец со вторичным флуоресцентно конъюгированным антителом в течение 30 минут при комнатной температуре, защищая его от света. После инкубации слейте раствор антител и трижды промойте предметное стекло TBS.
Оставьте TBS на образце после окончательной промывки. Обезвоживают образец и подготавливают предметное стекло с покровным стеклом для микроскопической оценки, как показано на рисунке. Включите микроскоп и флуоресцентный источник света и сфокусируйте эритроциты в режиме яркого поля.
Сделайте снимки в светлом поле и флуоресцентные изображения, по крайней мере, в трех различных областях тестовой области слайда, выбранных случайным образом. Установите время экспозиции на одну секунду для флуоресцентных изображений и сделайте снимок. Затем переключитесь в режим яркого поля, установите время экспозиции на «Авто» и сделайте соответствующее изображение с ярким полем.
Сохраните изображения в формате TIFF. Получение флуоресцентных и светлопольных изображений по меньшей мере в двух отдельных случайно выбранных областях контрольной области предметного стекла. Сохраняйте изображения в формате TIFF, чтобы сохранить исходные значения серого в пикселях, предотвратить сжатие и сохранить метаданные съемки.
Чтобы измерить значения серого для захваченных эритроцитов, откройте ImageJ. Отметьте каждую ячейку инструментом «Овальное выделение» и проанализируйте с помощью команды «Измерить». Выделите от трех до пяти областей, свободных от эритроцитов, и определите значения серого для измерения фонового сигнала.
Чтобы выполнить альтернативный анализ данных полученных изображений, создайте макрокоманду в версии ImageJ для Фиджи для автоматического выбора, коррекции фона и анализа значений серого для данного изображения. Откройте изображение в формате TIFF для анализа на Фиджи. Затем откройте эритроцитную флуоресценцию.
ijm и нажмите кнопку Выполнить. Сигнал антител, направленных против синтазы оксида азота RBC, или NOS, фосфорилированной в остатке серина 1177 в состоянии покоя и в ответ на воздействие механического воздействия, оценивали с помощью иммуногистохимии и иммунофлюоресценции. При оценке иммуногистохимическим или иммунофлуоресцентным методом было обнаружено трехкратное увеличение сигнала антител, направленных против эритроцитов, фосфорилированных в остатке серина 1177, в ответ на воздействие эритроцитов по сравнению с соответствующими нестрижеными клетками.
Пользователю необходимо убедиться, что антитело нанесено только на тестовую область. В противном случае проба не может быть проанализирована из-за отсутствия элемента управления. Учитывая наличие большого разнообразия антител, с помощью этого метода возможно нацеливание на множество различных белков и сигнальных процессов.
