Unsere Methode ermöglicht mechanistische subzelluläre Untersuchungen im schnelllebigen Bereich der Mechanobiologie, indem temporäre Proteinmodifikationen fixiert und anschließend mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. Diese Methode ist technisch einfach anzuwenden. Die Ergebnisse sind hochvalide und reproduzierbar.
Im Vergleich zu anderen Techniken könnte unsere Methode auch auf dem aufstrebenden Gebiet der posttranslationalen Erythrozyten-Signaltransduktion eingesetzt werden, die von temporären Proteinmodifikationen, insbesondere der Erythrozyten-Mechanosignalisierung, abhängt. Um eine Erythrozytenproteinfixierung durchzuführen, wird Vollblut im Verhältnis eins zu zwei in 4%iger Paraformaldehydlösung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur verdünnt. Zentrifugieren Sie die Blutlösung bei 132 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
Resuspendieren Sie das Erythrozytenpellet in zwei Volumina von 0,1 molaren PBS und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Probe erneut und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Erythrozytenpellet in einem Volumen von 0,1 molaren PBS resuspendieren. Beschriften Sie einen Objektträger mit der Proben-ID und dem mit einem alkoholbeständigen Stift applizierten Antikörper.
Fügen Sie 10 Mikroliter der zubereiteten Erythrozytenlösung hinzu. Legen Sie einen zweiten Objektträger in einem Winkel von 45 Grad auf die Probe und verteilen Sie die Probe gleichmäßig entlang des Objektträgers. Erhitzefixieren Sie den Objektträger, indem Sie die Probe mit einer konstanten Bewegung fünf bis sieben Sekunden lang über den Bunsenbrenner schweben lassen.
Für die immunhistochemische Färbung markieren Sie den 2/3-Bereich des Objektträgers als Test und 1/3 als Kontrolle mit einem Fettstift. Waschen Sie dann die Probenbereiche zweimal, indem Sie TBS 30 Sekunden lang auftragen. Fügen Sie nach dem zweiten Waschen 0,1 % Trypsin hinzu und decken Sie den Objektträger mit einer speziell angefertigten Inkubationskammer mit einem Deckel ab.
Die Probe wird 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Füllen Sie ein Becherglas mit Leitungswasser und stoppen Sie die Enzymreaktion, indem Sie das Leitungswasser aus dem Becherglas auf den Objektträger geben. Gießen Sie die Lösung ab und waschen Sie beide Bereiche dreimal mit TBS.
Nach dem letzten Waschen Peroxidase-Blockierungslösung hinzufügen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation die Lösung abgießen und beide Bereiche dreimal mit TBS waschen. Dann 3%ige Magermilchlösung hinzufügen und 30 Minuten inkubieren.
Nach der Inkubation wird die Lösung abgegossen und die primäre Antikörperlösung in den Testbereich gegeben. Geben Sie die Antikörperkontrolllösung in den Kontrollbereich. Inkubieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius über Nacht.
Gießen Sie am nächsten Tag die Antikörperlösung ab und waschen Sie beide Bereiche dreimal mit TBS. Fügen Sie dann 3%normale Ziegenserumlösung hinzu, um eine unspezifische Bindung zu verhindern, und inkubieren Sie 30 Minuten lang. Nach der Inkubation wird eine sekundäre Antikörperlösung zugegeben und 30 Minuten lang inkubiert.
Gießen Sie die Antikörperlösung ab und waschen Sie die Bereiche dreimal mit TBS, bevor Sie mit der Entwicklung der Färbung fortfahren. Um anschließend eine Avidin-gekoppelte Meerrettichperoxidase-Reaktion durchzuführen, fügen Sie verdünnte Avidinperoxidase-Lösung hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang. Legen Sie den Objektträger mit 200-facher Vergrößerung unter ein Mikroskop und geben Sie frisch zubereitete DAB-Lösung in beide Bereiche.
Überwachen Sie die Färbung der Erythrozyten kontinuierlich und stoppen Sie die Färbung, indem Sie die DAB-Lösung mit einer Einwegpipette entfernen, bevor der Hintergrund zu färben beginnt. Um eine Probentrocknung durchzuführen, legen Sie den Objektträger in ein Glasgestell und tauchen Sie ihn jeweils fünf Sekunden lang in steigende Ethanolkonzentrationen und schließlich in Xylol ein. Legen Sie den Objektträger nach dem Austrocknen mit den Erythrozyten nach oben auf Seidenpapier, um überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen.
Geben Sie zwei oder drei Tropfen Eindeckmedium auf ein Deckglas und decken Sie das Objektträger mit dem Deckglas ab. Zur Visualisierung und Bildgebung legen Sie den Objektträger in ein Durchlichtmikroskop in Verbindung mit einer Kamera. Schalten Sie die Lichtquelle und die Kamera ein und starten Sie die Software.
Fokussieren Sie im Hellfeldmodus die RBCs, indem Sie die Knöpfe für die Grob- und Feinfokuseinstellung drehen. Fokussieren Sie die Erythrozyten in ähnlicher Weise im Fluoreszenzmodus. Um den Grauwert der Erythrozyten zu analysieren, markieren Sie die Kante jeder Erythrozyte mit dem ovalen Auswahlwerkzeug in der ImageJ-Software.
Messen Sie mit dem Befehl Messen Sie die Grauwerte von 50 Erythrozyten aus dem Test und 10 Erythrozyten aus der Steuerung. Für die Immunfluoreszenzfärbung von Erythrozytenproteinen wird die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem sekundären fluoreszenzkonjugierten Antikörper inkubiert, um sie vor Licht zu schützen. Nach der Inkubation gießen Sie die Antikörperlösung ab und waschen Sie den Objektträger dreimal mit TBS.
Belassen Sie die TBS nach der letzten Wäsche auf der Probe. Dehydrieren Sie die Probe und bereiten Sie den Objektträger mit einem Deckglas für die mikroskopische Auswertung vor, wie gezeigt. Schalten Sie das Mikroskop und die Leuchtstofflampe ein und fokussieren Sie die Erythrozyten im Hellfeldmodus.
Erfassen Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbilder in mindestens drei verschiedenen Bereichen des Testbereichs des zufällig ausgewählten Objektträgers. Stellen Sie die Belichtungszeit für fluoreszierende Bilder auf eine Sekunde ein und nehmen Sie ein Bild auf. Wechseln Sie dann in den Hellfeld-Modus, stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto und nehmen Sie das entsprechende Hellfeldbild auf.
Speichern Sie die Bilder im TIFF-Format. Nehmen Sie Fluoreszenz- und Hellfeldbilder in mindestens zwei verschiedenen, zufällig ausgewählten Bereichen des Kontrollbereichs des Objektträgers auf. Speichern Sie die Bilder im TIFF-Format, um die ursprünglichen Grauwerte der Pixel beizubehalten, eine Komprimierung zu verhindern und Metadaten der Aufnahme zu enthalten.
Um die Grauwerte der erfassten Erythrozyten zu messen, öffnen Sie ImageJ. Markieren Sie jede Zelle mit dem ovalen Auswahlwerkzeug und analysieren Sie sie mit dem Befehl Messen. Markieren Sie zwischen drei und fünf Bereiche, die frei von Erythrozyten sind, und bestimmen Sie die Grauwerte, um das Hintergrundsignal zu messen.
Um eine alternative Datenanalyse der aufgenommenen Bilder durchzuführen, erstellen Sie einen Makrobefehl über die Fidschi-Version von ImageJ für die automatische Auswahl, Hintergrundkorrektur und Grauwertanalyse eines bestimmten Bildes. Öffnen Sie das Bild im TIFF-Format zur Analyse in Fidschi. Öffnen Sie dann die Erythrozytenfluoreszenz.
IJM-Makro und klicken Sie auf Ausführen. Das Signal von Antikörpern, die gegen die Erythrozyten-Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) gerichtet sind, die am Serin-1177-Rest im Ruhezustand und als Reaktion auf mechanische Krafteinwirkung phosphoryliert wurden, wurde sowohl mit Immunhistochemie als auch mit Immunfluoreszenz untersucht. Ein dreifacher Anstieg des Signals von Antikörpern, die gegen Erythrozyten-NOS gerichtet sind, die am Serin-1177-Rest phosphoryliert sind, wurde als Reaktion auf mechanische Kraftexposition von Erythrozyten im Vergleich zu den jeweiligen nicht gescherten Zellen nachgewiesen, wenn sie entweder mit der immunhistochemischen oder der Immunfluoreszenzmethode untersucht wurden.
Der Benutzer muss sicherstellen, dass der Antikörper nur auf den Testbereich aufgetragen wird. Andernfalls kann die Probe aufgrund einer fehlenden Kontrolle nicht analysiert werden. Aufgrund der Verfügbarkeit einer Vielzahl von Antikörpern ist es mit dieser Methode möglich, viele verschiedene Proteine und Signalprozesse anzusprechen.
