Yöntemimiz, geçici protein modifikasyonlarını yerinde sabitleyerek ve daha sonra bunları spesifik antikorlarla tespit ederek hızlı hareket eden mekanobiyoloji alanında mekanik hücre altı araştırmaları mümkün kılar. Bu yöntemin uygulanması teknik olarak kolaydır. Sonuçlar son derece geçerli ve tekrarlanabilir.
Ayrıca, diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, yöntemimiz, geçici protein modifikasyonlarına, özellikle de kırmızı hücre mekanosinyalizasyonuna bağlı olan, gelişmekte olan translasyon sonrası kırmızı kan hücresi sinyalizasyonu alanında gerçekten etkili bir şekilde kullanılabilir. RBC protein fiksasyonunu gerçekleştirmek için, tam kanı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisinde bir ila iki oranında seyreltin. Kan çözeltisini oda sıcaklığında üç dakika boyunca 132 g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın.
RBC peletini iki hacim 0.1 molar PBS'de yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Yine, numuneyi santrifüjleyin ve RBC peletini 0.1 molar PBS'lik bir hacimde yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı çıkarın. Bir mikroskop lamını, alkole dayanıklı bir kalem kullanarak uygulanan numune kimliği ve antikor ile etiketleyin.
Hazırlanan RBC çözeltisinden 10 mikrolitre ekleyin. Numunenin üzerine 45 derecelik bir açıyla ikinci bir slayt yerleştirin ve numuneyi slayt boyunca eşit olarak dağıtın. Numuneyi beş ila yedi saniye boyunca sabit bir hareketle Bunsen brülörünün üzerinde gezdirerek slaydı ısıyla sabitleyin.
İmmünohistokimya boyaması için, lamın 2/3 alanını test olarak ve 1/3'ünü bir yağlı kalem kullanarak kontrol olarak işaretleyin. Daha sonra TBS'yi 30 saniye boyunca uygulayarak numune alanlarını iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra,% 0.1 tripsin ekleyin ve kapaklı, amaca yönelik bir inkübasyon odası kullanarak slaydı kapatın.
Numuneyi 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Bir behere musluk suyu doldurun ve beherden gelen musluk suyunu lam üzerine ekleyerek enzim reaksiyonunu durdurun. Solüsyonu dökün ve her iki alanı da TBS ile üç kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra peroksidaz bloke edici solüsyon ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, çözeltiyi dökün ve her iki alanı da TBS ile üç kez yıkayın. Sonra% 3 yağsız süt çözeltisi ekleyin ve 30 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, çözeltiyi dökün ve birincil antikor çözeltisini test alanına ekleyin. Kontrol alanına antikor kontrol solüsyonu ekleyin. Numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, antikor çözeltisini dökün ve her iki alanı da TBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için% 3 normal keçi serumu çözeltisi ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, ikincil bir antikor çözeltisi ekleyin ve 30 dakika inkübe edin.
Antikor çözeltisini dökün ve lekelenme gelişimine geçmeden önce alanları TBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, avidin bağlı bir yaban turpu peroksidaz reaksiyonu gerçekleştirmek için, seyreltilmiş avidin peroksidaz çözeltisi ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Slaytı 200 kat büyütmede mikroskop altına yerleştirin ve her iki alana da taze hazırlanmış DAB solüsyonu ekleyin.
RBC'lerin lekelenmesini sürekli olarak izleyin ve arka plan renklenmeye başlamadan önce DAB solüsyonunu tek kullanımlık bir pipetle çıkararak lekelenmeyi durdurun. Numune dehidrasyonunu gerçekleştirmek için, slaytı bir cam rafa yerleştirin ve her biri beş saniye boyunca artan etanol konsantrasyonlarına ve son olarak ksilole daldırın. Dehidrasyondan sonra, fazla sıvıyı emmek için slaytı RBC'ler üstte olacak şekilde kağıt mendil üzerine yerleştirin.
Bir kapak kızağına iki veya üç damla montaj ortamı ekleyin ve kapak kızağını kullanarak sürgüyü kapatın. Görselleştirme ve görüntüleme için, slaydı bir kamera ile birleştirilmiş iletilen bir ışık mikroskobuna yerleştirin. Işık kaynağını ve kamerayı açın ve yazılımı başlatın.
Parlak Alan Modu altında, kaba ve ince odak ayar düğmelerini çevirerek RBC'lere odaklanın. Benzer şekilde, RBC'leri Floresan Modunda odaklayın. RBC gri değerini analiz etmek için, ImageJ yazılımındaki Oval Seçim Aracı'nı kullanarak her RBC'nin kenarını işaretleyin.
Ölç komutunu kullanarak, testten 50 RBC'nin ve denetimden 10 RBC'nin gri değerlerini ölçün. RBC proteinlerinin immünofloresan boyaması için, numuneyi ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ikincil bir floresan konjuge antikor ile inkübe edin. İnkübasyondan sonra, antikor çözeltisini dökün ve slaydı TBS ile üç kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra TBS'yi numune üzerinde bırakın. Numuneyi kurutun ve gösterildiği gibi mikroskobik değerlendirme için lamı bir kapak fişi ile hazırlayın. Mikroskobu ve flüoresan ışık kaynağını açın ve RBC'leri Parlak Alan Modunda odaklayın.
Rastgele seçilen slaydın test alanının en az üç farklı alanında parlak alan ve floresan görüntüler yakalayın. Floresan görüntüler için pozlama süresini bir saniyeye ayarlayın ve bir görüntü yakalayın. Ardından Parlak Alan Moduna geçin, pozlama süresini Otomatik olarak ayarlayın ve ilgili parlak alan görüntüsünü yakalayın.
Görüntüleri TIFF formatında kaydedin. Slaytın kontrol alanının rastgele seçilen en az iki farklı alanında floresan ve parlak alan görüntüleri yakalayın. Piksellerin orijinal gri değerlerini korumak, sıkıştırmayı önlemek ve alımın meta verilerini taşımak için görüntüleri TIFF formatında kaydedin.
Yakalanan RBC'lerin gri değerlerini ölçmek için ImageJ'yi açın. Her hücreyi Oval Seçim Aracı ile işaretleyin ve Ölçün komutunu kullanarak çözümleyin. RBC'lerden arındırılmış üç ila beş alanı vurgulayın ve arka plan sinyalini ölçmek için gri değerleri belirleyin.
Yakalanan görüntülerin alternatif veri analizini gerçekleştirmek için, belirli bir görüntünün otomatik seçimi, arka plan düzeltmesi ve gri değer analizi için ImageJ'nin Fiji sürümü aracılığıyla bir makro komutu oluşturun. Fiji'de analiz için TIFF formatındaki görüntüyü açın. Ardından RBC floresansını açın.
ijm makrosunu tıklatın ve Çalıştır'ı tıklatın. Serin 1177 kalıntısında istirahatte ve mekanik kuvvete maruz kalmaya yanıt olarak fosforile edilen RBC Nitrik Oksit Sentaz veya NOS'a karşı hedeflenen antikorların sinyali, hem immünohistokimya hem de immünofloresan kullanılarak değerlendirildi. İmmünohistokimyasal veya immünofloresan yöntemi ile değerlendirildiğinde, RBC'lerin mekanik kuvvete maruz kalmasına yanıt olarak, serin 1177 kalıntısında fosforile edilen RBC-NOS'a karşı hedeflenen antikorların sinyalinde üç kat artış tespit edildi.
Kullanıcının, antikorun sadece test alanına uygulandığından emin olması gerekir. Aksi takdirde, eksik bir kontrol nedeniyle numune analiz edilemez. Çok çeşitli antikorların mevcudiyeti göz önüne alındığında, bu yöntem kullanılarak birçok farklı proteini ve sinyal sürecini hedeflemek mümkündür.
