Nosso método possibilita investigações subcelulares mecanísticas no campo da mecanobiologia em rápida evolução, fixando modificações proteicas temporárias no local e detectando-as com anticorpos específicos. Este método é tecnicamente fácil de aplicar. Os resultados são altamente válidos e reprodutíveis.
Além disso, em comparação com outras técnicas, nosso método poderia realmente ser usado efetivamente no campo emergente da sinalização pós-traducional de hemácias, que é dependente de modificações proteicas temporárias, especialmente mecanosinalização de hemácias. Para realizar a fixação da proteína eritrocitária, diluir o sangue total na proporção de um para dois em solução de paraformaldeído a 4% por 20 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar a solução de sangue a 132 g durante três minutos à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o sobrenadante.
Ressuspender o pellet de hemácias em dois volumes de PBS 0,1 molar e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Novamente, centrifugar a amostra e remover o sobrenadante antes de ressuspender o pellet de hemácias em um volume de PBS 0,1 molar. Rotular uma lâmina de microscópio com o ID da amostra e o anticorpo aplicado usando uma caneta resistente ao álcool.
Adicione 10 microlitros da solução preparada de RBC. Coloque uma segunda lâmina sobre a amostra em um ângulo de 45 graus e disperse a amostra uniformemente ao longo da lâmina. Fixe a lâmina passando a amostra sobre o queimador de Bunsen com um movimento constante por cinco a sete segundos.
Para a coloração imunoistoquímica, marcar a área 2/3 da lâmina como teste e 1/3 como controle com lápis graxa. Em seguida, lave as áreas de amostra duas vezes aplicando TBS por 30 segundos. Após a segunda lavagem, adicione 0,1% de tripsina e cubra a lâmina usando uma câmara de incubação construída especificamente com uma tampa.
Incubar a amostra durante 30 minutos a 37 graus Celsius. Encha um copo com água da torneira e pare a reação enzimática adicionando a água da torneira do copo na lâmina. Despeje a solução e lave ambas as áreas três vezes com TBS.
Após a lavagem final, adicionar solução bloqueadora de peroxidase e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, despeje a solução e lave ambas as áreas três vezes com TBS. Em seguida, adicione 3% de solução de leite desnatado e incube por 30 minutos.
Após a incubação, despeje a solução e adicione a solução de anticorpos primários à área de teste. Adicione a solução de controle de anticorpos à área de controle. Incubar as amostras a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, despeje a solução de anticorpos e lave ambas as áreas três vezes com TBS. Em seguida, adicione solução de soro de cabra normal a 3% para evitar ligação inespecífica e incube por 30 minutos. Após a incubação, adicione uma solução de anticorpos secundários e incube por 30 minutos.
Despeje a solução de anticorpos e lave as áreas três vezes com TBS antes de prosseguir para o desenvolvimento da coloração. Em seguida, para realizar uma reação de peroxidase de rábano acoplada à avidina, adicione solução diluída de peroxidase de avidina e incube por 30 minutos. Coloque a lâmina sob um microscópio com aumento de 200 vezes e adicione a solução DAB recém-preparada em ambas as áreas.
Monitore a coloração das hemácias continuamente e pare a coloração removendo a solução DAB com uma pipeta descartável antes que o fundo comece a colorir. Para realizar a desidratação da amostra, coloque a lâmina em uma grade de vidro e mergulhe por cinco segundos cada em concentrações crescentes de etanol e, finalmente, em xilol. Após a desidratação, coloque a lâmina sobre papel higiênico com as hemácias na parte superior para absorver o excesso de líquido.
Adicione duas ou três gotas de meio de montagem em uma folha de tampa e cubra a corrediça usando a folha de tampa. Para visualização e obtenção de imagens, coloque a lâmina em um microscópio de luz transmitida acoplado a uma câmera. Ligue a fonte de luz e a câmera e inicie o software.
No Modo Campo Brilhante, concentre as hemácias girando os botões de ajuste de foco grosso e fino. Da mesma forma, concentre as hemácias no Modo Fluorescente. Para analisar o valor de cinza RBC, marque a borda de cada RBC usando a Oval Selection Tool dentro do software ImageJ.
Usando o comando Measure, meça os valores de cinza de 50 RBCs do teste e 10 RBCs do controle. Para a coloração por imunofluorescência das proteínas eritrocitárias, incubar a amostra com um anticorpo secundário fluorescentemente conjugado por 30 minutos à temperatura ambiente, protegendo-a da luz. Após a incubação, despeje a solução de anticorpos e lave a lâmina três vezes com TBS.
Deixe o TBS na amostra após a lavagem final. Desidratar a amostra e preparar a lâmina com uma lamínula para avaliação microscópica conforme demonstrado. Ligue o microscópio e a fonte de luz fluorescente e concentre as hemácias em um modo de campo brilhante.
Capture imagens fluorescentes e de campo claro em pelo menos três áreas distintas da área de teste da lâmina selecionada aleatoriamente. Defina o tempo de exposição para um segundo para imagens fluorescentes e capture uma imagem. Em seguida, alterne para o Modo de Campo Brilhante, defina o tempo de exposição como Automático e capture a imagem de campo brilhante correspondente.
Salve as imagens no formato TIFF. Capture imagens fluorescentes e de campo brilhante em pelo menos duas áreas distintas selecionadas aleatoriamente da área de controle da lâmina. Salve as imagens no formato TIFF para preservar os valores de cinza originais dos pixels, impedir a compactação e transportar metadados da aquisição.
Para medir os valores de cinza das hemácias capturadas, abra o ImageJ. Marque cada célula com a Ferramenta de Seleção Oval e analise usando o comando Medir. Realce entre três e cinco áreas livres de hemácias e determine os valores de cinza para medir o sinal de fundo.
Para executar a análise de dados alternativos de imagens capturadas, crie um comando de macro por meio da versão Fiji do ImageJ para seleção automatizada, correção de plano de fundo e análise de valor de cinza de uma determinada imagem. Abra a imagem em formato TIFF para análise em Fiji. Em seguida, abra a fluorescência RBC.
ijm macro e clique em Executar. O sinal de anticorpos direcionados contra a eritrocitária óxido nítrico sintase, ou NOS, fosforilado no resíduo de serina 1177 em repouso e em resposta à exposição à força mecânica foi avaliado por imunohistoquímica e imunofluorescência. Um aumento de três vezes no sinal de anticorpos direcionados contra eritrócitos-NOS fosforilados no resíduo de serina 1177 foi detectado em resposta à exposição à força mecânica das hemácias em comparação com as respectivas células não cisalhadas, quando avaliadas pelo método imunohistoquímico ou imunofluorescência.
O usuário precisa se certificar de que o anticorpo é aplicado apenas na área de teste. Caso contrário, a amostra não poderá ser analisada, devido à falta de um controle. Dada a disponibilidade de uma ampla variedade de anticorpos, o direcionamento de muitas proteínas diferentes e processos de sinalização é possível usando este método.
