Il nostro metodo rende possibili indagini meccanicistiche subcellulari nel campo in rapida evoluzione della meccanobiologia fissando modifiche proteiche temporanee in atto e quindi rilevandole con anticorpi specifici. Questo metodo è tecnicamente facile da applicare. I risultati sono altamente validi e riproducibili.
Inoltre, rispetto ad altre tecniche, il nostro metodo potrebbe davvero essere utilizzato efficacemente nel campo emergente della segnalazione post-traduzionale dei globuli rossi, che dipende da modifiche proteiche temporanee, in particolare la meccanosegnalazione dei globuli rossi. Per eseguire la fissazione della proteina RBC, diluire il sangue intero in un rapporto di uno a due in soluzione di paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la soluzione di sangue a 132 g per tre minuti a temperatura ambiente e rimuovere con cura il surnatante.
Risospendere il pellet RBC in due volumi di PBS molare 0,1 e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Ancora una volta, centrifugare il campione e rimuovere il surnatante prima di risospendere il pellet RBC in un volume di 0,1 molari PBS. Etichettare un vetrino da microscopio con l'ID del campione e l'anticorpo applicato utilizzando una penna resistente all'alcool.
Aggiungere 10 microlitri della soluzione RBC preparata. Posizionare un secondo vetrino sul campione con un angolo di 45 gradi e disperdere uniformemente il campione lungo il vetrino. Fissare a caldo il vetrino passando il campione sopra il bruciatore Bunsen con un movimento costante per cinque-sette secondi.
Per la colorazione immunoistochimica, contrassegnare l'area 2/3 del vetrino come test e 1/3 come controllo utilizzando una matita grassa. Quindi lavare le aree del campione due volte applicando TBS per 30 secondi. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere lo 0,1% di tripsina e coprire il vetrino utilizzando una camera di incubazione appositamente costruita con un coperchio.
Incubare il campione per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Riempire un becher con acqua di rubinetto e interrompere la reazione enzimatica aggiungendo l'acqua del rubinetto dal becher sul vetrino. Versare la soluzione e lavare entrambe le aree tre volte con TBS.
Dopo il lavaggio finale, aggiungere la soluzione di blocco della perossidasi e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, versare la soluzione e lavare entrambe le aree tre volte con TBS. Quindi aggiungere una soluzione di latte scremato al 3% e incubare per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, versare la soluzione e aggiungere la soluzione anticorpale primaria all'area di prova. Aggiungere la soluzione di controllo degli anticorpi all'area di controllo. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, versare la soluzione anticorpale e lavare entrambe le aree tre volte con TBS. Quindi aggiungere una soluzione di siero di capra normale al 3% per evitare un legame aspecifico e incubare per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere una soluzione anticorpale secondaria e incubare per 30 minuti.
Versare la soluzione anticorpale e lavare le aree tre volte con TBS prima di procedere allo sviluppo della colorazione. Successivamente, per eseguire una reazione di perossidasi di rafano accoppiata ad avidina, aggiungere la soluzione diluita di avidina perossidasi e incubare per 30 minuti. Posizionare il vetrino al microscopio con un ingrandimento di 200 volte e aggiungere la soluzione DAB appena preparata a entrambe le aree.
Monitorare continuamente la colorazione dei globuli rossi e interrompere la colorazione rimuovendo la soluzione DAB con una pipetta usa e getta prima che lo sfondo inizi a colorarsi. Per eseguire la disidratazione del campione, posizionare il vetrino in una griglia di vetro e immergere per cinque secondi ciascuno in concentrazioni crescenti di etanolo e, infine, in xilolo. Dopo la disidratazione, posizionare il vetrino su carta velina con i globuli rossi nella parte superiore per assorbire il liquido in eccesso.
Aggiungere due o tre gocce di supporto di montaggio su una copertina e coprire la diapositiva utilizzando la linguetta di copertina. Per la visualizzazione e l'imaging, posizionare il vetrino in un microscopio a luce trasmessa accoppiato con una fotocamera. Accendere la sorgente luminosa e la fotocamera e avviare il software.
In modalità campo luminoso, mettere a fuoco i globuli rossi ruotando le manopole di regolazione della messa a fuoco grossolane e fini. Allo stesso modo, mettere a fuoco i globuli rossi in modalità fluorescente. Per analizzare il valore di grigio RBC, contrassegnare il bordo di ciascun RBC utilizzando lo strumento di selezione ovale all'interno del software ImageJ.
Utilizzando il comando Misura, misurare i valori di grigio di 50 RBC dal test e 10 RBC dal controllo. Per la colorazione immunofluorescente delle proteine RBC, incubare il campione con un anticorpo secondario coniugato fluorescentmente per 30 minuti a temperatura ambiente, proteggendolo dalla luce. Dopo l'incubazione, versare la soluzione anticorpale e lavare il vetrino tre volte con TBS.
Lasciare il TBS sul campione dopo il lavaggio finale. Disidratare il campione e preparare il vetrino con un vetrino di copertura per la valutazione microscopica come dimostrato. Accendere il microscopio e la sorgente luminosa fluorescente e mettere a fuoco i globuli rossi in modalità campo luminoso.
Acquisire immagini in campo chiaro e fluorescenti in almeno tre aree distinte dell'area di test della diapositiva selezionata a caso. Impostare il tempo di esposizione su un secondo per le immagini fluorescenti e acquisire un'immagine. Quindi passare alla modalità Bright-Field, impostare il tempo di esposizione su Auto e acquisire l'immagine in campo luminoso corrispondente.
Salva le immagini in formato TIFF. Acquisire immagini fluorescenti e in campo chiaro in almeno due aree distinte selezionate casualmente dell'area di controllo della diapositiva. Salvare le immagini in formato TIFF per preservare i valori di grigio originali dei pixel, impedire la compressione e trasportare i metadati dell'acquisizione.
Per misurare i valori di grigio dei globuli rossi acquisiti, aprire ImageJ. Contrassegnare ogni cella con lo strumento Selezione ovale e analizzarla utilizzando il comando Misura. Evidenziare da tre a cinque aree prive di globuli rossi e determinare i valori di grigio per misurare il segnale di fondo.
Per eseguire analisi alternative dei dati delle immagini acquisite, creare un comando macro tramite la versione Fiji di ImageJ per la selezione automatica, la correzione dello sfondo e l'analisi dei valori di grigio di una determinata immagine. Aprire l'immagine in formato TIFF per l'analisi nelle Figi. Quindi aprire la fluorescenza dei globuli rossi.
macro ijm e fare clic su Esegui. Il segnale di anticorpi mirati contro l'ossido nitrico sintasi RBC, o NOS, fosforilati al residuo di serina 1177 a riposo e in risposta all'esposizione alla forza meccanica è stato valutato utilizzando sia l'immunoistochimica che l'immunofluorescenza. Un aumento di tre volte del segnale degli anticorpi mirati contro RBC-NOS fosforilati al residuo di serina 1177 è stato rilevato in risposta all'esposizione alla forza meccanica dei globuli rossi rispetto alle rispettive cellule non tranciate quando valutato con il metodo immunoistochimico o immunofluorescenza.
L'utente deve assicurarsi che l'anticorpo venga applicato solo all'area di test. In caso contrario, il campione non può essere analizzato, a causa di un controllo mancante. Data la disponibilità di un'ampia varietà di anticorpi, è possibile indirizzare molte proteine diverse e processi di segnalazione utilizzando questo metodo.
