우리의 방법은 일시적인 단백질 변형을 제자리에 고정한 다음 특정 항체로 검출함으로써 빠르게 변화하는 기계생물학 분야에서 기계론적 세포 내 조사를 가능하게 합니다. 이 방법은 기술적으로 적용하기 쉽습니다. 결과는 매우 타당하고 재현 가능합니다.
또한, 다른 기술과 비교하여, 우리의 방법은 일시적인 단백질 변형, 특히 적혈구 기계 신호전달에 의존하는 번역 후 적혈구 신호 전달의 새로운 분야에서 실제로 효과적으로 사용될 수 있습니다. RBC 단백질 고정을 수행하려면 실온에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드 용액에 1:2의 비율로 전혈을 희석합니다. 혈액 용액 132g을 실온에서 3분 동안 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 제거한다.
RBC 펠릿을 0.1몰 PBS의 두 부피로 재현탁하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 다시, 샘플을 원심분리하고, RBC 펠릿을 0.1 몰 PBS의 1 부피로 재현탁하기 전에 상청액을 제거한다. 현미경 슬라이드에 샘플 ID와 적용된 항체를 알코올 내성 펜으로 표시합니다.
준비된 RBC 용액 10 마이크로 리터를 첨가하십시오. 샘플에 두 번째 슬라이드를 45도 각도로 놓고 샘플을 슬라이드를 따라 고르게 분산시킵니다. 5-7초 동안 일정한 움직임으로 샘플을 분젠 버너 위로 가져가서 슬라이드를 열 고정합니다.
면역조직화학 염색의 경우 그리스 연필을 사용하여 슬라이드의 2/3 영역을 테스트로, 1/3 영역을 대조군으로 표시합니다. 그런 다음 30초 동안 TBS를 적용하여 샘플 영역을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 0.1% 트립신을 넣고 뚜껑이 있는 특수 제작된 배양 챔버를 사용하여 슬라이드를 덮습니다.
섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 비커에 수돗물을 채우고 비커의 수돗물을 슬라이드에 추가하여 효소 반응을 중지합니다. 용액을 붓고 TBS로 두 부위를 세 번 씻으십시오.
최종 세척 후 퍼옥시다아제 차단 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양한다. 배양 후 용액을 붓고 TBS로 두 부위를 세 번 씻습니다. 그런 다음 3% 탈지유 용액을 넣고 30분 동안 배양합니다.
배양 후 용액을 붓고 1차 항체 용액을 테스트 영역에 추가합니다. 항체 대조 용액을 대조군에 추가합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.
다음날, 항체 용액을 붓고 TBS로 두 부위를 세 번 씻으십시오. 그런 다음 3% 정상 염소 혈청 용액을 첨가하여 비특이적 결합을 방지하고 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 2차 항체 용액을 첨가하고 30분 동안 인큐베이션한다.
항체 용액을 붓고 TBS로 해당 부위를 세 번 씻은 후 염색을 진행하십시오. 다음으로, 아비딘 결합 양 고추 냉이 과산화 효소 반응을 수행하기 위해, 희석 된 아비 딘 퍼 옥시다제 용액을 첨가하고 30 분 동안 배양한다. 슬라이드를 200배 배율로 현미경으로 놓고 새로 준비한 DAB 용액을 두 영역에 추가합니다.
적혈구의 염색을 지속적으로 모니터링하고 배경이 착색되기 전에 일회용 피펫으로 DAB 용액을 제거하여 염색을 중지합니다. 샘플 탈수를 수행하려면 슬라이드를 유리 랙에 넣고 에탄올 농도를 높이고 마지막으로 자일롤에 각각 5초 동안 담그십시오. 탈수 후 상단에 적혈구가 있는 티슈 페이퍼에 슬라이드를 올려 과도한 액체를 흡수합니다.
커버 슬립에 장착 매체를 2-3방울 떨어뜨리고 커버 슬립을 사용하여 슬라이드를 덮습니다. 시각화 및 이미징을 위해 슬라이드를 카메라와 결합된 투과광 현미경에 놓습니다. 광원과 카메라를 켜고 소프트웨어를 시작합니다.
Bright-Field Mode(명시야 모드)에서 거칠고 미세한 초점 조정 노브를 돌려 RBC의 초점을 맞춥니다. 마찬가지로 형광 모드에서 RBC의 초점을 맞춥니다. RBC 회색 값을 분석하려면 ImageJ 소프트웨어 내의 Oval Selection Tool을 사용하여 각 RBC의 가장자리를 표시합니다.
측정 명령을 사용하여 검정에서 50 적외선과 대조군에서 10 적외선의 회색 값을 측정합니다. RBC 단백질의 면역 형광 염색을 위해, 샘플을 실온에서 30 분 동안 2 차 형광 접합 항체와 함께 배양하여 빛으로부터 보호한다. 배양 후 항체 용액을 붓고 TBS로 슬라이드를 세 번 세척합니다.
최종 세척 후 샘플에 TBS를 남겨 둡니다. 샘플을 탈수하고 시연된 대로 현미경 평가를 위해 커버 슬립으로 슬라이드를 준비합니다. 현미경과 형광등을 켜고 명시야 모드에서 RBC의 초점을 맞춥니다.
임의로 선택된 슬라이드의 테스트 영역 중 최소 3개의 별개 영역에서 명시야 및 형광 이미지를 캡처합니다. 형광 이미지의 노출 시간을 1초로 설정하고 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 명시야 모드로 전환하고 노출 시간을 자동으로 설정한 다음 해당 명시야 이미지를 캡처합니다.
이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다. 슬라이드의 제어 영역에서 무작위로 선택된 최소 2개의 별개의 영역에서 형광 및 명시야 이미지를 캡처합니다. 이미지를 TIFF 형식으로 저장하여 픽셀의 원래 회색 값을 유지하고, 압축을 방지하고, 획득의 메타데이터를 전달합니다.
캡처된 적혈구의 회색 값을 측정하려면 ImageJ를 엽니다. 타원형 선택 도구로 각 셀을 표시하고 측정 명령을 사용하여 분석합니다. 적혈구가 없는 3개에서 5개 사이의 영역을 강조 표시하고 배경 신호를 측정할 회색 값을 결정합니다.
캡처된 이미지의 대체 데이터 분석을 수행하려면 ImageJ의 피지 릴리스를 통해 지정된 이미지의 자동 선택, 배경 보정 및 회색 값 분석을 위한 매크로 명령을 만듭니다. 피지에서 분석할 TIFF 형식 이미지를 엽니다. 그런 다음 RBC 형광을 엽니다.
ijm 매크로를 선택하고 실행을 클릭합니다. RBC 산화질소 합성효소(NOS)를 표적으로 하는 항체의 신호는 휴식 시 세린 1177 잔기에서 인산화되고 기계적 힘 노출에 대한 반응으로 면역조직화학 및 면역형광을 모두 사용하여 평가되었습니다. 세린 1177 잔기에서 인산화된 RBC-NOS에 대한 항체의 신호 증가는 면역조직화학적 또는 면역형광법으로 평가했을 때 각각의 전단되지 않은 세포와 비교하여 RBC의 기계적 힘 노출에 대한 반응으로 검출되었습니다.
사용자는 항체가 테스트 영역에만 적용되었는지 확인해야 합니다. 그렇지 않으면 대조군이 누락되어 샘플을 분석할 수 없습니다. 다양한 항체의 가용성을 감안할 때 이 방법을 사용하여 다양한 단백질 및 신호 전달 과정을 표적으로 삼을 수 있습니다.
