Los compuestos fotocontrolados biológicamente activos contienen fragmentos reversiblemente fotoisorizables, fotointerruptores en sus moléculas. Los compuestos son péptidos cíclicos modificados por un fragmento de diarileteno que sufre transformaciones electrocíclicas reversibles inducidas por la luz. Pueden fotocambiar, es decir, alternar entre una forma biológicamente inactiva generada por UV y una forma biológicamente activa generada por luz roja.
Se cree que los medicamentos fotoconmutables son más seguros que los medicamentos no fotoconmutables. Esto se debe a que puede administrar una forma no tóxica y desactivada al cuerpo humano y activarla localmente con luz solo donde la necesite, que es, por ejemplo, tumores, sinfines o heridas. No existen métodos o protocolos estándar para el desarrollo preclínico o clínico de tales medicamentos fotofarmacología, por lo que aquí queremos mostrarle experimentos que pueden usarse para esta investigación preclínica temprana.
Kateryna Horbatok y Tetiana Makhnii demostrarán los procedimientos. El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Comisión de Bioética de la Empresa Bienta. Comience preparando los búferes utilizando procedimientos estándar.
Alternativamente, utilice soluciones disponibles comercialmente. Preparar soluciones stock de compuestos. Para cada compuesto, pesar dos lotes de 5,12 miligramos del compuesto en la fotoforma cerrada con anillo en dos tubos Eppendorf de 1,5 mililitros, uno con paredes transparentes y otro con paredes negras no transparentes.
Como control positivo, pesar 2,28 miligramos del péptido padre, no fotocontrolado, en un tubo adicional. Agregue 100 microlitros de DMSO puro a cada muestra y vórtice durante 30 segundos. Fotoisomerizar la solución madre en el tubo de paredes transparentes irradiando la solución con un láser de 650 nanómetros, densidad de potencia de luz de 6 vatios por centímetro cuadrado, con vórtice para garantizar la mezcla.
Continúe hasta que el color cambie de púrpura oscuro a marrón claro. Proteger de la luz con papel de aluminio. Semilla de 5, 000 a 10, 000 células por pocillo.
Utilizamos alrededor de 8, 000 células de carcinoma de pulmón de Lewis en 200 microlitros de DMEM en los 60 pocillos centrales de una placa estéril de 96 pocillos con un fondo transparente y paredes negras no transparentes. Llene los 36 pozos restantes con DMEM puro. Incubar las placas a 37 grados centígrados en una atmósfera de 5% de CO2 durante la noche.
Al día siguiente, prepare diluciones seriadas de compuestos y el control positivo en placas transparentes en autoclave de polipropileno. Comience con las existencias en DMSO y diluya con DMEM, pero no exceda el 1% de volumen de DMSO en la concentración final más alta. Para evitar la fotoisomerización incontrolada de los compuestos estudiados, apague las luces del gabinete estéril.
Transfiera 100 microlitros de las diluciones a 56 pocillos con 100 microlitros de DMEM previamente agregado para alcanzar la concentración final requerida de los compuestos en los pozos, típicamente dentro del rango de cinco a 150 micromolares. A continuación, agregue 100 microlitros de DMEM a cuatro pocillos, que sirven como control negativo. Cubra las placas con papel de aluminio o una cubierta de plástico no transparente para evitar el fotocambio incontrolado.
Coloque las placas en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados durante el tiempo de incubación elegido. Después de las incubaciones, agregue 50 microlitros de solución de tinción por pocillo a las placas. Utilice Hoechst 33342 de cinco micromolares y yoduro de propidio de un micromolar como soluciones de tinción finales para este experimento.
Incubar de nuevo a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Realice imágenes de fluorescencia automatizadas utilizando una lente objetiva de aumento de 20X. Las operaciones de laboratorio para esta parte del método son idénticas a las descritas para el experimento 2D: preparación del cultivo celular, incubación con los compuestos probados e imágenes.
Sin embargo, en este caso, las células se preparan como esferoides compactos y maduros en una placa de fondo en U de adhesión ultra baja de 384 pocillos con paredes negras no transparentes. El uso de una placa de este tamaño permite comparar dos compuestos en un experimento. En este experimento, utilizamos además calceína AM como un tercer componente de la solución de tinción multicolor.
Las imágenes obtenidas de los experimentos 2D y 3D se analizan utilizando el software de análisis automatizado de imágenes de los instrumentos. Las células costadas con colorantes de yoduro de Hoechst y propidio se consideran necróticamente muertas, y su fracción en función de la concentración se utiliza para calcular el valor de IC50. Montar el tren óptico para la irradiación de la muestra.
Consiste en un cable óptico de la fuente de luz láser, una lente con una distancia focal variable, una jeringa con una cubierta no transparente y un extremo de corte plano. Todas las operaciones posteriores deben realizarse en una habitación oscura con una iluminación mínima en el lugar de trabajo. Preparar una muestra de tejido modelo cargada con los compuestos fotoformales inactivos.
En una carrera típica, cinco gramos de carne de cerdo fresca picada se mezclan mecánicamente con la solución PBS del compuesto para alcanzar la concentración final de 50 miligramos por kilogramo. Llene la jeringa con la muestra cargada. Irradiar la muestra en el tren óptico para la exposición requerida y el tiempo de dosificación de luz.
Después de la exposición, haga rodajas de cuatro milímetros de espesor de la muestra empujando la masa fuera de la jeringa con el pistón y cortándola con un bisturí. Pese y extraiga el compuesto con un acetonitrilo, agua, mezcla de TFA, 70% de acetonitrilo y 01% de ácido trifluoroacético en un tubo de Eppendorf de 1,5 mililitros. Centrifugar a 20XG durante 30 minutos dos veces para eliminar el material insoluble y recoger el sobrenadante.
Grabe cromatogramas detectados UV con una detección de 570 nanómetros de su forma cerrada y una detección de 270 nanómetros de la forma abierta en anillo. Utilice las muestras de control no irradiadas e irradiadas preparadas de manera similar a las soluciones madre en los experimentos celulares para determinar los tiempos de retención específicos y calibrar el método. Repita el experimento tres veces y trace el porcentaje normalizado de cada fotoforma en la gráfica, porcentaje versus distancia desde la superficie del tejido irradiado.
En el día cero, inocular los ratones C57 negros 6 hembras adultas que pesan aproximadamente 20 gramos cada uno por vía subcutánea con una suspensión de alrededor de medio millón de células de carcinoma de pulmón de Lewis en aproximadamente 100 microlitros de DMEM y mezcla de Matrigel en la pata trasera derecha. Este procedimiento se realiza bajo sedación con isoflurano al 5%. Los animales están listos para el tratamiento en los días cinco a ocho, cuando los tumores son palpables.
Todas las operaciones que impliquen ser probado deben realizarse en condiciones de semioscuridad. Esta condición también se mantiene cuando se trata a los animales después de recibir la dosis compuesta durante un período de dos días. Reúna al azar cuatro grupos de ocho animales y retire el pelaje del área del tumor.
Los dos grupos de control reciben una inyección intravenosa del vehículo. 100 microlitros de solución salina por animal de 20 gramos, y los animales de los dos grupos experimentales recibieron el compuesto probado en la fotoforma inactiva en una solución de un miligramo por mililitro de solución salina. Administrar el bolo compuesto en la vena de la cola a cinco mililitros por kilo.
Dos horas, 45 minutos después de que se haya inyectado el compuesto, irradie el área del tumor durante 20 minutos bajo anestesia con isoflurano con un láser de 650 nanómetros, utilizando una densidad de potencia de luz de 100 milivatios por centímetro cuadrado. Observe cuidadosamente las condiciones de los animales durante los próximos 30 minutos. Observar a los animales diariamente, y medir su peso y las dimensiones de sus tumores.
Mida los volúmenes tumorales y observe la progresión de la necrosis. Determinar la tasa de supervivencia mediante el procedimiento estándar. Los resultados de nuestro protocolo para el paso uno en el caso de experimentos de cultivo celular 2D se pueden presentar como imágenes, como se ilustra aquí en una imagen representativa de células de carcinoma de pulmón de Lewis incubadas con LMB002 a diferentes concentraciones y durante diferentes períodos de la incubación.
Costaining con Hoechst y yoduro de propidio permite la visualización de núcleos celulares en el canal azul, dando así un recuento total de células. Se observaron células con integridad comprometida de la membrana plasmática en el canal rojo. Suponiendo que este último esté necrosóticamente muerto, la citotoxicidad aparente de un compuesto en estudio puede cuantificarse como un porcentaje de las células positivas para yoduro de propidio.
Los resultados de la cuantificación de datos obtenidos a través del análisis automatizado de imágenes se muestran aquí. Para LMB002, se pueden observar dependencias sigmoidales del porcentaje de células positivas para yoduro de propidio en la concentración del compuesto. A partir de estos datos, se pueden determinar los valores de IC50.
Nuestro experimento reveló que la forma abierta de LMB002 es aproximadamente un paso de dilución menos tóxica que el péptido prototipo, gramicidina S, mientras que la forma cerrada demuestra de tres a cuatro pasos de dilución menor toxicidad, que aumenta con el tiempo de incubación. Los experimentos de células 3D produjeron el mismo tipo de datos sin procesar, las imágenes esferoides resueltas de una sola célula por pared. La inclusión de calceína como tercer colorante de tinción permite cuantificar la fracción de células metabólicamente activas observadas en el canal verde.
Las curvas de efecto de dosis, como las del experimento 2D, se obtuvieron de las pilas de imágenes de la pila Z. El panel A ilustra tales curvas, corroborando los resultados 2D. Como se muestra en el panel B, el diámetro total del esferoide varía con la concentración del compuesto.
El experimento para el paso dos permite la determinación de las concentraciones de LMB002 en ambas fotoformas mediante el uso de cromatografía líquida de alta resolución detectada por UV. Ambas fotoformas fueron suficientemente diferentes en tiempos de retención y absorbancia, mostradas integradas en los paneles A y B de la figura. Los datos obtenidos se resumen en la figura, confirmando que nuestra fuente de luz roja induce la fotoconversión LMB002 cerrada con anillo a una profundidad de hasta un centímetro en la madre sustituta tisular, carne picada a aproximadamente 103 milivatios por centímetro cuadrado.
Los resultados del experimento in vivo, paso tres de nuestra metodología, fueron representados por gráficos que muestran el crecimiento tumoral en función del tiempo en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. La estrategia representada aquí para evaluar candidatos a fármacos fotoconmutables es práctica y adecuada para compuestos con fotointerruptores de tipo diariletén. Paso uno, la cuantificación de citotoxicidad se puede utilizar para el cribado inicial de las bibliotecas de los compuestos fotocontrolados.
Paso dos, la evaluación de la eficiencia de la fotoconmutación es fácil de configurar y ética. No requiere animales vivos. Paso tres, modelos de fotofarmacología in vivo, la terapia se puede aplicar a animales pequeños.
