광조절된 생물학적 활성 화합물은 분자에 가역적으로 광이성질체화 가능한 단편, 광스위치를 포함합니다. 화합물은 가역적 광 유도 전기 순환 변환을 겪는 diarylethene 단편에 의해 변형된 고리형 펩타이드입니다. 그들은 광 전환, 즉 UV에서 생성되고 생물학적으로 비활성 형태와 적색광에서 생성되고 생물학적으로 활성 형태 사이를 전환할 수 있습니다.
광전환이 가능한 약물은 광전환이 불가능한 약물보다 안전하다고 믿어집니다. 이는 인체에 독성이 없고 비활성화된 형태를 투여하고 필요한 곳(예: 종양, 오거 또는 상처)에만 빛으로 국소적으로 활성화할 수 있기 때문입니다. 이러한 광약리학 약물의 전임상 또는 임상 개발을 위한 표준 방법이나 프로토콜이 없으므로 여기에서는 이 초기 전임상 연구에 사용할 수 있는 실험을 보여드리고자 합니다.
카테리나 호르바톡(Kateryna Horbatok)과 테티아나 마흐니(Tetiana Makhnii)가 절차를 시연할 것입니다. 동물 관리 및 실험 절차는 Bienta Company의 생명 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 먼저 표준 절차를 사용하여 버퍼를 준비합니다.
또는 상업적으로 이용 가능한 솔루션을 사용하십시오. 화합물의 원액을 준비하십시오. 각 컴파운드에 대해 링 폐쇄 포토폼에 있는 5.12mg의 컴파운드 배치 2개를 1.5밀리리터 Eppendorf 튜브 2개(하나는 투명 튜브, 다른 하나는 투명 벽이 있는 튜브)로 계량합니다.
양성 대조군으로, 여분의 튜브에 2.28 밀리그램의 부모 (photocontroled)가 아닌 펩타이드의 무게를 잰다. 각 샘플에 100 마이크로리터의 순수 DMSO를 첨가하고, 30초 동안 와동시킨다. 650나노미터 레이저, 광출력 밀도 6와트/센티미터 제곱, 혼합을 보장하기 위해 볼텍싱으로 용액을 조사하여 투명 벽 튜브의 저장 용액을 광이성질화합니다.
색상이 짙은 자주색에서 밝은 갈색으로 바뀔 때까지 계속하십시오. 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호하십시오. 웰 당 5, 000 내지 10, 000 세포를 시드한다.
우리는 투명한 바닥과 검은 색의 불투명 벽을 가진 96 웰 멸균 플레이트의 중앙 60 웰에서 200 마이크로 리터의 DMEM에서 약 8, 000 개의 루이스 폐암 세포를 사용했습니다. 나머지 36개의 웰을 순수 DMEM으로 채웁니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 5% CO2 대기에서 배양합니다.
다음날, 화합물의 연속 희석액과 폴리프로필렌 오토클레이브 투명 플레이트에서 양성 대조군을 준비합니다. DMSO에 있는 주식으로 시작하고, DMEM로 묽게 하되, 마지막 가장 높은 농도에 있는 1% 부피 DMSO를 초과하지 마십시오. 연구된 화합물의 제어되지 않은 광이성질화를 방지하려면 멸균 캐비닛의 조명을 끄십시오.
100 마이크로리터의 희석액을 100 마이크로리터의 미리 첨가된 DMEM과 함께 56 웰로 옮겨 웰 내의 화합물의 필요한 최종 농도(일반적으로 5 내지 150 마이크로몰 범위 내)에 도달합니다. 다음으로, 100 마이크로리터의 DMEM을 음성 대조군 역할을 하는 4개의 웰에 추가합니다. 제어되지 않은 광 전환을 방지하기 위해 알루미늄 호일 또는 플라스틱 불투명 덮개로 플레이트를 덮으십시오.
선택한 배양 시간 동안 섭씨 37도의 세포 배양 배양기에 플레이트를 놓습니다. 배양 후, 웰 당 50 마이크로 리터의 염색 용액을 플레이트에 첨가한다. 이 실험의 최종 염색 용액으로 5마이크로몰 Hoechst 33342 및 1마이크로몰 프로피듐 요오드화물을 사용합니다.
섭씨 37도에서 20분 동안 다시 배양합니다. 20X 배율 대물 렌즈를 사용하여 자동 형광 이미징을 수행합니다. 이 부분에 대한 실험실 작업은 2D 실험에 대해 설명된 것과 동일합니다: 세포 배양 준비, 테스트된 화합물로 배양 및 이미징.
그러나 이 경우 셀은 검은색 불투명 벽이 있는 384웰, 초저접착, U자형 바닥 플레이트에서 콤팩트하고 성숙한 스페로이드로 준비됩니다. 이 크기의 플레이트를 사용하면 한 번의 실험에서 두 화합물을 비교할 수 있습니다. 본 실험에서는 다색 염색 용액의 제3성분으로 칼세인 AM을 추가로 사용하였다.
2D 및 3D 실험에서 얻은 이미지는 기기의 자동 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. Hoechst 및 프로피듐 요오드화물 염료로 염색 된 세포는 괴사 적으로 죽은 것으로 간주되며, 농도의 함수로서의 분획은 IC50 값을 계산하는 데 사용됩니다. 샘플 조사를 위한 광학 트레인을 조립합니다.
레이저 광원의 광 케이블, 가변 초점 거리의 렌즈, 불투명 커버가 있는 주사기 및 평평한 절단 끝으로 구성됩니다. 모든 후속 작업은 작업장 조명이 최소화된 어두운 방에서 수행해야 합니다. 비활성 광형성 화합물이 로딩된 모델 조직 샘플을 준비합니다.
전형적인 실행에서, 5 그램의 신선한 다진 돼지 고기를 킬로그램 당 50 밀리그램의 최종 농도에 도달하기 위해 화합물의 PBS 용액과 기계적으로 혼합된다. 로드된 샘플로 주사기를 채웁니다. 필요한 노출 및 광량 시간 동안 광학 트레인에 있는 샘플을 조사합니다.
노출 후 피스톤으로 주사기에서 덩어리를 밀어내고 메스로 절단하여 4mm 두께의 샘플 조각을 만듭니다. 1.5밀리리터 Eppendorf 튜브에서 아세토니트릴, 물, TFA 혼합물, 70% 아세토니트릴 및 01% 트리플루오로아세트산으로 화합물을 칭량하고 추출합니다. 20XG에서 30분 동안 2회 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고 상층액을 수집하였다.
밀폐형 형태의 570나노미터 검출 및 링 개방 형태의 270나노미터 검출에서 UV 검출 크로마토그램을 기록합니다. 세포 실험에서 원액과 유사하게 제조된 조사되지 않은 대조군 샘플과 조사된 대조군 샘플을 사용하여 특정 머무름 시간을 결정하고 방법을 보정합니다. 실험을 3회 반복하고, 조사된 조직 표면으로부터의 거리 대비 백분율 대 각 광형의 정규화된 백분율을 플롯에 플로팅한다.
제로일에, 각각 체중이 약 20 그램인 C57 검정 6 마우스 성인 암컷을 오른쪽 뒷다리에 약 100 마이크로리터의 DMEM 및 매트리겔 믹스에 약 500만 개의 루이스 폐 암종 세포의 현탁액으로 피하 주사한다. 이 절차는 5% 이소플루란 진정 작용 하에 수행됩니다. 동물들은 종양이 만져지는 5 일에서 8 일 사이에 치료할 준비가되었습니다.
테스트와 관련된 모든 작업은 반암석 조건에서 수행해야 합니다. 이 상태는 2 일 동안 복합 용량을 투여받은 후 동물을 치료할 때도 유지됩니다. 8 마리의 동물로 구성된 4 개의 그룹을 무작위로 조립하고 종양 부위에서 털을 제거합니다.
두 대조군은 비히클의 정맥 주사를 받습니다. 20-그램 동물 당 100 마이크로리터 식염수, 및 2개의 실험 그룹의 동물들은 1 밀리리터 식염수 당 1 밀리그램의 용액 중의 불활성 광형으로 시험된 화합물을 받았다. 화합물 볼루스를 킬로당 5밀리리터로 꼬리 정맥에 투여합니다.
화합물이 주입 된 후 2 시간 45 분 후, 평방 센티미터 당 100 밀리 와트의 광 출력 밀도를 사용하여 650 나노 미터 레이저로 이소 플루란 마취하에 20 분 동안 종양 부위를 조사합니다. 다음 30분 동안 동물의 상태를 주의 깊게 관찰하십시오. 매일 동물을 관찰하고 체중과 종양의 크기를 측정하십시오.
종양 부피를 측정하고 괴사의 진행을 기록하십시오. 표준 절차를 사용하여 생존율을 결정하십시오. 2D 세포 배양 실험의 경우 1단계에 대한 당사의 프로토콜 결과는 LMB002와 함께 상이한 농도 및 상이한 배양 기간 동안 배양된 루이스 폐암 세포에 대한 대표 이미지에 예시된 바와 같이 이미지로 제시될 수 있다.
Hoechst 및 프로피듐 요오드화물과 함께 염색하면 청색 채널에서 세포핵을 시각화하여 총 세포 수를 얻을 수 있습니다. 원형질막의 손상된 완전성을 갖는 세포가 적색 채널에서 관찰되었다. 후자가 괴사적으로 죽었다고 가정하면, 연구 중인 화합물의 명백한 세포독성은 프로피듐 요오드화물 양성 세포의 백분율로 정량화될 수 있습니다.
자동화된 이미지 분석을 통해 얻은 데이터 정량화 결과가 여기에 표시됩니다. LMB002의 경우, 화합물 농도에서 프로피듐 요오드화물 양성 세포의 백분율의 S자 모이드 의존성을 볼 수 있습니다. 이 데이터에서 IC50 값을 결정할 수 있습니다.
우리의 실험은 LMB002의 개방 형태가 프로토 타입 펩타이드 인 Gramicidin S보다 약 1 희석 단계 덜 독성이 있는 반면, 폐쇄 형태는 배양 시간에 따라 증가하는 3-4 희석 단계 낮은 독성을 보여줍니다. 3D 세포 실험은 동일한 유형의 원시 데이터, 단일 세포 분해 벽당 하나의 스페로이드 이미지를 생성했습니다. 세 번째 염색 염료로 칼세인을 포함하면 녹색 채널에서 관찰되는 대사 활성 세포의 분획을 정량화할 수 있습니다.
2D 실험에서와 같은 선량 효과 곡선은 Z-스택 이미지 더미에서 얻었습니다. 패널 A는 이러한 곡선을 보여 주며 2D 결과를 확증합니다. 패널 B에서 볼 수 있듯이 전체 스페로이드 직경은 화합물 농도에 따라 달라집니다.
2단계 실험에서는 UV 검출 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 두 광형에서 LMB002 농도를 측정할 수 있습니다. 두 광형은 머무름 시간과 흡광도에서 충분히 상이했으며, 그림의 패널 A와 B에 통합되어 표시되었습니다. 얻어진 데이터는 그림에 요약되어 있으며, 우리의 적색 광원이 조직 대리모에서 최대 1센티미터의 깊이에서 고리 폐쇄 LMB002 광변환을 유도한다는 것을 확인하며, 다진 고기는 제곱센티미터당 약 103밀리와트입니다.
우리 방법론의 3단계인 생체 내 실험의 결과는 Kaplan-Meier 생존 곡선에서 시간의 함수로서 종양 성장을 보여주는 그래프로 표현되었습니다. 광전환 가능한 약물 후보를 평가하기 위해 여기에 제시된 전략은 실용적이며 디아릴에텐 유형 광전환이 있는 화합물에 적합합니다. 단계 1, 세포독성 정량화는 광조절 화합물의 라이브러리의 초기 스크리닝에 사용될 수 있다.
2단계, 광스위칭 효율 평가는 설정하기 쉽고 윤리적입니다. 살아있는 동물이 필요하지 않습니다. 단계 3, 생체내 광약리학 모델에서, 치료법은 작은 동물에 적용될 수 있다.
