Фотоуправляемые, биологически активные соединения содержат в своих молекулах обратимо фотоизомеризуемые фрагменты, фотопереключатели. Соединения представляют собой циклические пептиды, модифицированные фрагментом диарилетена, который подвергается обратимым светоиндуцированным электроциклическим превращениям. Они могут фотопереключаться, то есть переключаться между биологически неактивной формой, генерируемой ультрафиолетом, и биологически активной формой, генерируемой красным светом.
Считается, что фотопереключаемые препараты безопаснее, чем нефотопереключаемые. Это связано с тем, что вы можете вводить нетоксичную, дезактивированную форму в организм человека и локально активировать ее светом только там, где она вам нужна, а именно, например, при опухолях, шнеках или ранах. Не существует стандартных методов или протоколов для доклинической или клинической разработки таких фотофармакологических препаратов, поэтому здесь мы хотим показать вам эксперименты, которые могут быть использованы для этого раннего доклинического исследования.
Процедуры продемонстрируют Екатерина Горбаток и Татьяна Махний. Процедуры ухода за животными и эксперименты были одобрены Комиссией по биоэтике компании Bienta. Начните с подготовки буферов с использованием стандартных процедур.
В качестве альтернативы можно использовать коммерчески доступные решения. Приготовьте исходные растворы составов. Для каждого соединения взвесьте две партии по 5,12 миллиграмма соединения в фотоформе, закрытой кольцом, в две 1,5-миллилитровые пробирки Эппендорфа, одну с прозрачными и одну с черными непрозрачными стенками.
В качестве положительного контроля взвесьте 2,28 миллиграмма исходного, не фотоконтролируемого, пептида в дополнительной пробирке. Добавьте 100 микролитров чистого ДМСО к каждому образцу и встряхните в течение 30 секунд. Фотоизомеризуют исходный раствор в трубке с прозрачными стенками, облучая раствор 650-нанометровым лазером, плотность мощности света 6 Вт на квадратный сантиметр, с вихревом для обеспечения перемешивания.
Продолжайте до тех пор, пока цвет не изменится с темно-фиолетового на светло-коричневый. Защищайте от света алюминиевой фольгой. Посев от 5 000 до 10 000 клеток в лунку.
Мы использовали около 8 000 клеток карциномы легкого Льюиса в 200 микролитрах DMEM в центральных 60 лунках 96-луночной стерильной пластины с прозрачным дном и черными непрозрачными стенками. Заполните оставшиеся 36 скважин чистым ДМЭМ. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере 5% CO2 в течение ночи.
На следующий день приготовьте серийные разведения составов и положительный контроль в полипропиленовых автоклавных прозрачных пластинах. Начните с запасов в ДМСО и разбавьте ДМЭМ, но не превышайте 1% объема ДМСО в конечной максимальной концентрации. Для предотвращения неконтролируемой фотоизомеризации исследуемых соединений необходимо выключить свет в стерильном шкафу.
Перенесите 100 микролитров разбавлений в 56 лунок со 100 микролитрами ранее добавленного DMEM, чтобы достичь требуемой конечной концентрации соединений в лунках, обычно в диапазоне от пяти до 150 мкмоль. Затем добавьте 100 микролитров DMEM в четыре лунки, которые служат отрицательным контролем. Накройте пластины алюминиевой фольгой или пластиковой непрозрачной крышкой, чтобы предотвратить неконтролируемое фотопереключение.
Поместите планшеты в инкубатор клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия на выбранное время инкубации. После инкубации добавьте в пластины по 50 микролитров окрашивающего раствора на лунку. Используйте пятимикромолярный Hoechst 33342 и один микромолярный йодид пропидия в качестве окончательных окрашивающих растворов для этого эксперимента.
Снова инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. Выполняйте автоматическую флуоресцентную визуализацию с помощью объектива с 20-кратным увеличением. Лабораторные операции для этой части метода идентичны описанным для 2D-эксперимента: приготовление клеточной культуры, инкубация с испытуемыми соединениями и визуализация.
Однако в этом случае клетки получают в виде компактных, зрелых сфероидов в 384-луночной, сверхнизкой адгезии, U-образной нижней пластине с черными непрозрачными стенками. Использование пластины такого размера позволяет сравнивать два соединения в одном эксперименте. В этом эксперименте мы использовали дополнительно кальцеин АМ в качестве третьего компонента многоцветного окрашивающего раствора.
Изображения, полученные как в 2D, так и в 3D экспериментах, анализируются с помощью программного обеспечения для автоматического анализа изображений. Клетки, окрашенные красителями Хёхста и йодида пропидия, считаются некротически мертвыми, а их фракция в зависимости от концентрации используется для расчета значения IC50. Соберите оптический шлейф для облучения образца.
Он состоит из оптического кабеля от лазерного источника света, линзы с переменным фокусным расстоянием, шприца с непрозрачной крышкой и плоского обрезанного конца. Все последующие операции необходимо выполнять в затемненном помещении с минимальным освещением рабочего места. Подготовьте модельный образец ткани, загруженный неактивными фотоформальными соединениями.
В типичном прогоне пять граммов свежего свиного фарша механически смешивают с раствором PBS соединения, чтобы достичь конечной концентрации 50 миллиграммов на килограмм. Наполните шприц загруженным образцом. Облучайте образец в оптическом шлейфе для требуемой экспозиции и времени дозировки света.
После выдержки сделайте срезы образца толщиной четыре миллиметра, оттолкнув поршнем массу от шприца и разрезав ее скальпелем. Взвесьте и извлеките соединение с помощью ацетонитрила, воды, смеси TFA, 70% ацетонитрила и 01% трифторуксусной кислоты в 1,5-миллилитровой пробирке Эппендорфа. Центрифуга при 20XG в течение 30 минут два раза, чтобы удалить нерастворимый материал и собрать надосадочную жидкость.
Запись хроматограмм, обнаруженных УФ-излучением, при 570-нанометровом обнаружении их закрытой формы и 270-нанометровом обнаружении кольцевой открытой формы. Используйте необлученные и облученные контрольные образцы, приготовленные аналогично исходным растворам в экспериментах с клетками, чтобы определить конкретное время удержания и откалибровать метод. Повторите эксперимент три раза и нанесите на график нормализованный процент каждой фотоформы, процент в зависимости от расстояния от поверхности облученной ткани.
На нулевой день привите взрослым самкам черных мышей C57 6 весом примерно 20 граммов каждая подкожно суспензией около полумиллиона клеток карциномы легкого Льюиса примерно в 100 микролитрах смеси DMEM и Matrigel в правую заднюю ногу. Эта процедура проводится под 5%-ной седацией изофлураном. Животные готовы к лечению на пятый-восьмой день, когда опухоли прощупываются.
Все операции, связанные с тестированием, должны выполняться в полутемных условиях. Это условие сохраняется и при лечении животных после приема комплексной дозы в течение двух суток. Соберите случайным образом четыре группы из восьми животных и удалите шерсть из области опухоли.
Две контрольные группы получают внутривенную инъекцию транспортного средства. 100 микролитров физиологического раствора на 20-граммовое животное, и животные в двух экспериментальных группах получали испытуемое соединение в неактивной фотоформе в растворе один миллиграмм на миллилитр физиологического раствора. Введите сложный болюс в хвостовую вену из расчета пять миллилитров на килограмм.
Через два часа, 45 минут после введения соединения, облучают область опухоли в течение 20 минут под изофлурановой анестезией 650-нанометровым лазером, используя плотность мощности света 100 милливатт на квадратный сантиметр. Внимательно наблюдайте за состоянием животных в течение следующих 30 минут. Ежедневно наблюдайте за животными и измеряйте их вес и размеры опухолей.
Измерьте объемы опухоли и отметьте прогрессирование некроза. Определяют выживаемость с помощью стандартной процедуры. Результаты нашего протокола для первого шага в случае экспериментов с 2D-культивированием клеток могут быть представлены в виде изображений, как показано здесь на репрезентативном изображении клеток карциномы легкого Льюиса, инкубированных с LMB002 в различных концентрациях и в течение разных периодов инкубации.
Окрашивание с помощью Hoechst и йодида пропидия позволяет визуализировать ядра клеток в синем канале, тем самым давая общее количество клеток. Клетки с нарушенной целостностью плазматической мембраны наблюдались в красном канале. Предполагая, что последние некротически мертвы, очевидная цитотоксичность исследуемого соединения может быть количественно определена в процентах от йодид-положительных клеток пропидия.
Здесь показаны результаты количественной оценки данных, полученных с помощью автоматизированного анализа изображений. Для LMB002 можно увидеть сигмоидальные зависимости процентного содержания йодид-положительных клеток пропидия в концентрации соединения. По этим данным можно определить значения IC50.
Наш эксперимент показал, что открытая форма LMB002 примерно на одну стадию разведения менее токсична, чем прототип пептида Грамицидин S, тогда как закрытая форма демонстрирует на три-четыре стадии разведения более низкую токсичность, которая увеличивается со временем инкубации. Эксперименты с 3D-клетками дали тот же тип необработанных данных, одноклеточные разрешенные изображения сфероида с разрешением один на стену. Включение кальцеина в качестве третьего окрашивающего красителя позволяет количественно определить долю метаболически активных клеток, наблюдаемых в зеленом канале.
Кривые дозового эффекта, как и в 2D-эксперименте, были получены из стопок изображений Z-стека. Панель А иллюстрирует такие кривые, подтверждая 2D-результаты. Как показано на рисунке B, общий диаметр сфероида изменяется в зависимости от концентрации соединения.
Эксперимент на втором этапе позволяет определить концентрации LMB002 в обеих фотоформах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием. Обе фотоформы были достаточно разными по времени удержания и поглощению, показанным интегрированными на панелях А и В рисунка. Полученные данные обобщены на рисунке, подтверждающем, что наш источник красного света индуцирует замкнутое кольцо фотопревращение LMB002 на глубине до одного сантиметра в тканевом суррогате, мясном фарше примерно 103 милливатт на квадратный сантиметр.
Результаты эксперимента in vivo, третьего шага нашей методики, были представлены графиками, показывающими рост опухоли как функцию времени в кривых выживаемости Каплана-Мейера. Представленная здесь стратегия оценки фотопереключаемых кандидатов на лекарственные средства практична и подходит для соединений с фотопереключателями диарилетенного типа. На первом этапе количественное определение цитотоксичности может быть использовано для первоначального скрининга библиотек фотоконтролируемых соединений.
Во-вторых, оценка эффективности фотопереключения проста в настройке и этична. Для этого не требуются живые животные. Шаг третий, in vivo фотофармакологические модели, терапия может быть применена к мелким животным.
