光制御された生物学的に活性な化合物は、可逆的に光異性化可能なフラグメント、それらの分子中に光スイッチを含む。化合物は、可逆的な光誘起電気環変換を受けるジアリールエテンフラグメントによって修飾された環状ペプチドです。それらは、光スイッチ、つまり、UVで生成された生物学的に不活性な形態と赤色光で生成された生物学的に活性な形態を切り替えることができます。
光切り替え可能な薬物は、光切り替え不可能な薬物よりも安全であると考えられています。これは、無毒で不活性化された形態を人体に投与し、腫瘍、オーガー、創傷などの必要な場所でのみ光で局所的に活性化できるためです。このような光薬理学的薬物の前臨床または臨床開発のための標準的な方法やプロトコルはないので、ここでは、この初期の前臨床研究に使用できる実験を紹介したいと思います。
Kateryna HorbatokとTetiana Makhniiが手順を実演します。動物の世話と実験手順は、ビエンタ社の生命倫理委員会によって承認されました。まず、標準的な手順を使用してバッファーを準備します。
あるいは、市販の溶液を使用してください。化合物の原液を調製します。各コンパウンドについて、5.12ミリグラムのコンパウンドをリングクローズフォトフォームに2バッチ秤量し、2つの1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブ(1つは透明、もう1つは黒色の不透明壁)に入れます。
ポジティブコントロールとして、追加のチューブで、光制御されていない親ペプチドの2.28ミリグラムを量ります。各サンプルに100マイクロリットルの純粋なDMSOを加え、30秒間ボルテックスします。透明壁チューブ内のストック溶液を、650ナノメートルのレーザー、光パワー密度6ワット/センチメートル四方の光パワー密度、ボルテックスで照射して光異性化し、混合を確実にします。
色が濃い紫色から明るい茶色に変わるまで続けます。アルミホイルで光から保護してください。ウェルあたり5, 000〜10, 000個の細胞を播種する。
底部が透明で壁が黒く不透明な96ウェル滅菌プレートの中央60ウェルにある200マイクロリットルのDMEMに約8, 000個のルイス肺癌細胞を使用しました。残りの36ウェルを純粋なDMEMで満たします。プレートを摂氏37度で5%CO2雰囲気中で一晩インキュベートします。
翌日、化合物の段階希釈液とポジティブコントロールをポリプロピレンオートクレーブクリアプレートで調製します。DMSO中のストックから始めて、DMEMで希釈しますが、最終的な最高濃度で1%容量のDMSOを超えないようにしてください。研究対象化合物の制御されない光異性化を防ぐために、滅菌キャビネット内の照明を消してください。
100マイクロリットルの希釈液を56ウェルに移し、100マイクロリットルのDMEMを予め添加して、ウェル内の化合物の必要な最終濃度(通常は5〜150マイクロモルの範囲)に到達させます。次に、ネガティブコントロールとして機能する4つのウェルに100マイクロリットルのDMEMを追加します。制御されていない光スイッチングを防ぐために、プレートをアルミホイルまたはプラスチックの不透明なカバーで覆います。
選択したインキュベーション時間、プレートを摂氏37度の細胞培養インキュベーターに入れます。インキュベーション後、ウェルあたり50マイクロリットルの染色溶液をプレートに加えます。この実験の最終染色液として、5マイクロモルのヘキスト33342と1マイクロモルのヨウ化プロピジウムを使用します。
摂氏37度で20分間再びインキュベートします。倍率20倍の対物レンズを使用して自動蛍光イメージングを行います。この方法のこの部分の実験室操作は、2D実験で説明したものと同じです:細胞培養の調製、試験された化合物とのインキュベーション、およびイメージング。
ただし、この場合、細胞は、黒色の不透明な壁を備えた384ウェルの超低接着性のU底プレートで、コンパクトで成熟したスフェロイドとして調製されます。このサイズのプレートを使用すると、1回の実験で2つの化合物を比較することができます。本実験では、多色染色液の第3成分としてさらにカルセインAMを用いた。
2D実験と3D実験の両方から得られた画像は、機器の自動画像解析ソフトウェアを使用して分析されます。Hoechst色素およびヨウ化プロピジウム色素で共染色された細胞は壊死死していると見なされ、濃度の関数としてのそれらの画分を使用してIC50値を計算します。試料照射用の光列を組み立てます。
これは、レーザー光源からの光ケーブル、可変焦点距離のレンズ、不透明なカバー付きのシリンジ、およびフラットカットエンドで構成されています。その後のすべての操作は、職場の照明が最小限の暗い部屋で実行する必要があります。不活性なフォトホルマール化合物を装填したモデル組織サンプルを調製します。
典型的な実行では、5グラムの新鮮な豚ひき肉を化合物のPBS溶液と機械的に混合して、1キログラムあたり50ミリグラムの最終濃度に到達します。シリンジに装填したサンプルを充填します。必要な露光と光照射時間の間、光トレインでサンプルを照射します。
暴露後、ピストンでシリンジから塊を押し出し、メスで切断することにより、サンプルの厚さ4ミリメートルのスライスを作成します。化合物を計量し、アセトニトリル、水、TFA混合物、70%アセトニトリル、01%トリフルオロ酢酸で1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブで抽出します。20XGで30分間2回遠心分離して不溶性物質を除去し、上清を収集します。
密閉型を570ナノメートル検出、リングオープン型を270ナノメートル検出でUV検出クロマトグラムを記録します。細胞実験でストック溶液と同様に調製した非照射および照射対照サンプルを使用して、特定の保持時間を決定し、メソッドを校正します。実験を3回繰り返し、各写真形態の正規化されたパーセントをプロット上にプロットし、照射された組織表面からの距離に対する百分率をプロットした。
0日目に、体重約20グラムのC57ブラック6匹の成体雌に、右後肢の約100マイクロリットルのDMEMおよびマトリゲルミックス中の約50万個のルイス肺癌細胞の懸濁液を皮下接種する。この手順は、5%イソフルラン鎮静下で行われます。動物は、腫瘍が触知できる5〜8日目に治療の準備ができています。
テストを含むすべての操作は、半暗所で実行する必要があります。この状態は、2日間複合投与を受けた後に動物を治療するときにも成り立つ。8匹の動物からなる4つのグループをランダムに組み立て、腫瘍領域から毛皮を取り除きます。
2つの対照群は、ビヒクルの静脈内注射を受ける。20−グラムの動物当たり100マイクロリットルの生理食塩水、および2つの実験群の動物は、1ミリリットル当たり生理食塩水の溶液中で不活性光形態の試験化合物を受け取った。複合ボーラスを1キロあたり5ミリリットルで尾静脈に投与します。
化合物を注入してから2時間45分後に、1平方センチメートルあたり100ミリワットの光パワー密度を用いて、650ナノメートルのレーザーをイソフルラン麻酔下で20分間腫瘍領域に照射する。次の30分間にわたって動物の状態を注意深く観察します。動物を毎日観察し、体重と腫瘍の大きさを測定します。
腫瘍の体積を測定し、壊死の進行に注意してください。標準的な手順を使用して生存率を決定します。2D細胞培養実験の場合のステップ1のプロトコルの結果は、LMB002をさまざまな濃度でさまざまな期間インキュベーションしたルイス肺がん細胞の代表的な画像に示すように、画像として提示できます。
ヘキストとヨウ化プロピジウムとの共染色により、青色チャネルの細胞核を可視化することができ、それによって総細胞数が得られます。原形質膜の完全性が損なわれた細胞が赤色チャネルで観察された。後者が壊死していると仮定すると、研究中の化合物の明らかな細胞毒性は、ヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合として定量化することができる。
自動画像解析により得られたデータの定量化の結果を以下に示す。LMB002の場合、化合物濃度中のヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合のシグモイド依存性が見られる。これらのデータから、IC50値を決定することができます。
私たちの実験では、LMB002のオープン型はプロトタイプペプチドであるグラミシジンSよりも約1希釈ステップで毒性が低いのに対し、クローズド型は3〜4希釈ステップで毒性が低く、インキュベーション時間とともに増加することが明らかになりました。3Dセル実験では、同じタイプの生データ、つまり壁ごとに1つのセル分解された回転楕円体画像が生成されました。第3の染色色素としてカルセインを含めることで、グリーンチャネルで観察される代謝活性細胞の画分の定量が可能になります。
線量効果曲線は、2D実験の場合と同様に、Zスタックの画像の山から取得されました。パネルAはそのような曲線を示しており、2Dの結果を裏付けています。パネルBに示すように、全体のスフェロイド直径は化合物濃度によって変化する。
ステップ2の実験では、UV検出の高速液体クロマトグラフィーを使用して、両方のフォトフォームのLMB002濃度を測定できます。両方のフォトフォームは、保持時間および吸光度において十分に異なっていた、図のパネルAおよびB上に集積して示されている。得られたデータを図にまとめると、赤色光源が、組織サロゲートのひき肉の最大103cmの深さでリングクローズLMB002光変換を約103ミリワット/平方センチメートルで誘導することが確認されています。
我々の方法論のステップ3であるin vivo実験の結果は、Kaplan-Meier生存曲線における時間の関数としての腫瘍増殖を示すグラフによって表された。光切り替え可能な薬剤候補を評価するためのここでの戦略は実用的であり、ジアリールエテン型光スイッチを有する化合物に適しています。ステップ1、細胞毒性定量は、光制御化合物のライブラリーの初期スクリーニングに使用することができる。
ステップ2、光スイッチング効率評価は、セットアップが簡単で倫理的です。生きている動物は必要ありません。ステップ3は、インビボ光薬理学モデルにおいて、小動物に適用できる療法である。
