光控的生物活性化合物在其分子中含有可逆的光异构化片段，即光开关。化合物是由经历可逆光诱导电环转化的二芳基乙烯片段修饰的环肽。它们可以进行光切换，即在紫外线产生的生物活性形式和红光产生的生物活性形式之间切换。
据信，可光开关药物比不可光开关药物更安全。这是因为您可以对人体施用无毒、失活的形式，并且仅在您需要的地方（例如肿瘤、螺旋钻或伤口）用光局部激活它。此类光药理学药物的临床前或临床开发没有标准的方法或方案，因此在这里，我们想向您展示可用于早期临床前研究的实验。
Kateryna Horbatok和Tetiana Makhnii将演示这些程序。动物护理和实验程序得到了比恩塔公司生物伦理委员会的批准。首先使用标准过程准备缓冲区。
或者，使用市售解决方案。制备化合物的储备溶液。对于每种化合物，将两批5.12毫克的化合物在环闭光形式中称量到两个1.5毫升的Eppendorf管中，一个具有透明壁，另一个具有黑色，不透明壁。
作为阳性对照，在额外的管中称取2.28毫克亲本（非光控肽）。向每个样品中加入100微升纯DMSO，并涡旋30秒。通过用650纳米激光照射溶液，光功率密度为每平方厘米6瓦，涡旋以确保混合，从而对透明管中的储备溶液进行光异构化。
继续直到颜色从深紫色变为浅棕色。用铝箔避光。每孔接种5， 000至10， 000个细胞。
我们在 200 微升 DMEM 中使用了大约 8， 000 个 Lewis 肺癌细胞，在 96 孔无菌板的中央 60 孔中，底部透明，壁黑色，不透明。用纯DMEM填充剩余的36个孔。将板在 37 摄氏度的 5% COR 气氛中孵育过夜。
第二天，在聚丙烯高压灭菌的透明板中制备化合物的系列稀释液和阳性对照。从DMSO中的储备液开始，并用DMEM稀释，但不要超过最终最高浓度的1%体积DMSO。为防止所研究化合物不受控制的光异构化，请关闭无菌柜中的灯。
将 100 微升稀释液转移到 56 个孔中，加入 100 微升先前添加的 DMEM，以达到孔中化合物所需的最终浓度，通常在 5 到 150 微摩尔范围内。接下来，向四个孔中加入100微升DMEM，作为阴性对照。用铝箔或塑料非透明盖子覆盖板，以防止不受控制的光开关。
将板置于37摄氏度的细胞培养箱中，以选择孵育时间。孵育后，每孔向板中加入50微升染色溶液。使用五微摩尔Hoechst 33342和一微摩尔碘化丙啶作为本实验的最终染色溶液。
再次在 37 摄氏度下孵育 20 分钟。使用20倍放大率物镜进行自动荧光成像。这部分方法的实验室操作与2D实验中描述的操作相同：细胞培养物的制备，与测试化合物的孵育和成像。
然而，在这种情况下，细胞在具有黑色非透明壁的 384 孔、超低粘附、U 形底板中制备为致密、成熟的球状体。使用这种尺寸的板可以在一个实验中比较两种化合物。在这个实验中，我们还使用了钙黄绿素AM作为多色染色溶液的第三种成分。
使用仪器的自动图像分析软件分析从2D和3D实验中获得的图像。用Hoechst和碘化丙啶染料混合的细胞被认为是坏死的，它们的分数作为浓度的函数用于计算IC50值。组装用于样品照射的光学序列。
它由来自激光光源的光缆、具有可变焦距的透镜、带有非透明盖的注射器和扁平切割端组成。所有后续操作必须在黑暗的房间内进行，工作场所照明最少。制备加载了非活性光形式化合物的模型组织样品。
在典型的运行中，将五克新鲜的碎猪肉与化合物的PBS溶液机械混合，以达到每公斤50毫克的最终浓度。用装载的样品填充注射器。在光学序列中照射样品以获得所需的曝光和光剂量时间。
曝光后，用活塞将质量从注射器上推开并用手术刀切割，制作四毫米厚的样品切片。在 1.5 毫升 Eppendorf 管中用乙腈、水、TFA 混合物、70% 乙腈和 01% 三氟乙酸称量并提取化合物。在20XG下离心30分钟两次，除去不溶性物质并收集上清液。
以570纳米检测其封闭形式和270纳米检测环开形式记录紫外检测色谱图。使用与细胞实验中的储备溶液类似的非辐照和辐照对照样品来确定特定的保留时间并校准方法。重复实验三次，并在图上绘制每种光型的归一化百分比，百分比与与辐照组织表面的距离。
在第零天，将C57黑色6只成年雌性小鼠皮下接种，每只重约20克，在右后腿约100微升DMEM和Matrigel混合物中悬浮约五十万刘易斯肺癌细胞。此过程在5%异氟醚镇静下进行。动物准备在第五到第八天接受治疗，此时肿瘤可以触及。
所有涉及测试的操作都应在半黑暗条件下进行。在接受化合物剂量两天后治疗动物时，这种情况也成立。随机组装四组八只动物，并从肿瘤区域去除皮毛。
两个对照组接受载体的静脉注射。每20克动物100微升生理盐水，两个实验组中的动物在每毫升1毫克盐水的溶液中接受非活性光型的测试化合物。以每公斤五毫升的速度将化合物推注到尾静脉中。
注射化合物后2小时45分钟，使用每平方厘米100毫瓦的光功率密度，在异氟醚麻醉下用650纳米激光照射肿瘤区域20分钟。在接下来的30分钟内仔细观察动物的状况。每天观察动物，并测量它们的体重和肿瘤的尺寸。
测量肿瘤体积，并注意坏死的进展。使用标准程序确定存活率。在2D细胞培养实验的情况下，我们第一步的方案结果可以呈现为图像，如此处所示的Lewis肺癌细胞以不同浓度和不同孵育期与LMB002一起孵育的代表性图像所示。
用Hoechst和碘化丙啶共染允许蓝色通道中的细胞核可视化，从而获得总细胞计数。在红色通道中观察到质膜完整性受损的细胞。假设后者坏死，所研究化合物的表观细胞毒性可以量化为碘化丙啶阳性细胞的百分比。
此处显示了通过自动图像分析获得的数据量化结果。对于LMB002，可以看到化合物浓度中碘化丙啶阳性细胞百分比的S形依赖性。根据这些数据，可以确定IC50值。
我们的实验表明，LMB002的开放形式的毒性比原型肽Gramicidin S低约一个稀释步骤，而封闭形式显示出三到四个稀释步骤的毒性较低，毒性随着孵育时间的增加而增加。3D细胞实验产生相同类型的原始数据，即单细胞分辨的每壁一个球体图像。将钙黄绿素作为第三种染色染料可以定量在绿色通道中观察到的代谢活性细胞的比例。
剂量效应曲线，如2D实验中的曲线，是从Z-stack图像堆中获得的。图A说明了这些曲线，证实了2D结果。如图B所示，总球体直径随化合物浓度而变化。
第二步的实验允许使用紫外检测的高效液相色谱法测定两种光型中的LMB002浓度。两种光型在保留时间和吸光度方面都存在足够的差异，如图A和B图的图A和B所示。获得的数据总结在图中，证实我们的红色光源在组织替代物中以每平方厘米约103毫瓦的深度诱导环闭合LMB002光转换。
体内实验的结果，我们方法的第三步，用图表表示，显示肿瘤生长在Kaplan-Meier生存曲线中随时间变化的函数。这里介绍的用于评估可光开关候选药物的策略是实用的，适用于具有二芳基乙烯型光开关的化合物。第一步，细胞毒性定量可用于光控化合物文库的初步筛选。
第二步，光开关效率评估既易于设置又合乎道德。它不需要活的动物。第三步，体内光药理模型，该疗法可应用于小动物。
