I composti fotocontrollati e biologicamente attivi contengono frammenti fotoisomerizzabili in modo reversibile, fotointerruttori nelle loro molecole. I composti sono peptidi ciclici modificati da un frammento di diariletene che subisce trasformazioni elettrocicliche reversibili indotte dalla luce. Possono passare da una forma biologicamente inattiva generata dai raggi UV a una forma biologicamente attiva generata dalla luce rossa.
Si ritiene che i farmaci fotocommutabili siano più sicuri dei farmaci non fotocommutabili. Questo perché è possibile somministrare una forma non tossica e disattivata al corpo umano e attivarla localmente con la luce solo dove ne hai bisogno, che è, ad esempio, tumori, coclee o ferite. Non ci sono metodi o protocolli standard per lo sviluppo preclinico o clinico di tali farmaci fotofarmacologici, quindi qui, vogliamo mostrarvi esperimenti che possono essere utilizzati per questa prima ricerca preclinica.
Kateryna Horbatok e Tetiana Makhnii dimostreranno le procedure. Le procedure di cura degli animali e sperimentali sono state approvate dalla Commissione di Bioetica della Società Bienta. Iniziare preparando i buffer utilizzando le procedure standard.
In alternativa, utilizzare soluzioni disponibili in commercio. Preparare soluzioni stock di composti. Per ogni composto, pesare due lotti di 5,12 milligrammi del composto nella fotoforma chiusa ad anello in due tubi di Eppendorf da 1,5 millilitri, uno con pareti trasparenti e uno con pareti nere e non trasparenti.
Come controllo positivo, pesare 2,28 milligrammi del peptide genitore, non fotocontrollato, in un tubo extra. Aggiungere 100 microlitri di DMSO puro a ciascun campione e vortice per 30 secondi. Fotoisomerizzare la soluzione madre nel tubo a parete chiara irradiando la soluzione con un laser a 650 nanometri, densità di potenza luminosa 6 watt per centimetro quadrato, con vortice per garantire la miscelazione.
Continuare fino a quando il colore cambia da viola scuro a marrone chiaro. Proteggere dalla luce con un foglio di alluminio. Seme da 5.000 a 10.000 cellule per pozzetto.
Abbiamo usato circa 8.000 cellule di carcinoma polmonare di Lewis in 200 microlitri di DMEM nei 60 pozzetti centrali di una piastra sterile a 96 pozzetti con un fondo trasparente e pareti nere e non trasparenti. Riempire i restanti 36 pozzetti con DMEM puro. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al 5% di CO2 durante la notte.
Il giorno successivo, preparare le diluizioni seriali dei composti e il controllo positivo in piastre trasparenti autoclavate in polipropilene. Iniziare con le scorte in DMSO e diluire con DMEM, ma non superare l'1% del volume DMSO nella concentrazione finale più alta. Per evitare la fotoisomerizzazione incontrollata dei composti studiati, spegnere le luci nell'armadio sterile.
Trasferire 100 microlitri delle diluizioni in 56 pozzetti con 100 microlitri di DMEM precedentemente aggiunto per raggiungere la concentrazione finale richiesta dei composti nei pozzetti, tipicamente entro l'intervallo da cinque a 150 micromolari. Quindi, aggiungere 100 microlitri di DMEM a quattro pozzetti, che fungono da controllo negativo. Coprire le lastre con un foglio di alluminio o un coperchio di plastica non trasparente per evitare la commutazione incontrollata della foto.
Posizionare le piastre in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius per il tempo di incubazione scelto. Dopo le incubazioni, aggiungere 50 microlitri di soluzione colorante per pozzetto alle piastre. Utilizzare Hoechst 33342 a cinque micromolari e ioduro di propidio monomolare come soluzioni di colorazione finali per questo esperimento.
Incubare nuovamente a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Esegui l'imaging a fluorescenza automatizzato utilizzando un obiettivo con ingrandimento 20X. Le operazioni di laboratorio per questa parte del metodo sono identiche a quelle descritte per l'esperimento 2D: preparazione della coltura cellulare, incubazione con i composti testati e imaging.
Tuttavia, in questo caso, le cellule sono preparate come sferoidi compatti e maturi in una piastra a 384 pozzetti, ultra-bassa, con fondo a U con pareti nere e non trasparenti. L'uso di una piastra di queste dimensioni consente di confrontare due composti in un esperimento. In questo esperimento, abbiamo utilizzato in aggiunta calceina AM come terzo componente della soluzione di colorazione multicolore.
Le immagini ottenute dagli esperimenti 2D e 3D vengono analizzate utilizzando il software di analisi delle immagini automatizzato degli strumenti. Le cellule sottoposte a coloranti Hoechst e ioduro di propidio sono considerate necroticamente morte e la loro frazione in funzione della concentrazione viene utilizzata per calcolare il valore IC50. Assemblare il treno ottico per l'irradiazione del campione.
È costituito da un cavo ottico dalla sorgente di luce laser, una lente con una lunghezza focale variabile, una siringa con un coperchio non trasparente e un'estremità tagliata piatta. Tutte le operazioni successive devono essere eseguite in una stanza buia con illuminazione minima del posto di lavoro. Preparare un campione di tessuto modello caricato con i composti fotoformali inattivi.
In una corsa tipica, cinque grammi di carne di maiale macinata fresca vengono miscelati meccanicamente con la soluzione PBS del composto per raggiungere la concentrazione finale di 50 milligrammi per chilogrammo. Riempire la siringa con il campione caricato. Irradiare il campione nel treno ottico per l'esposizione richiesta e il tempo di dosaggio della luce.
Dopo l'esposizione, fare quattro fette di campione spesse quattro millimetri spingendo la massa fuori dalla siringa con il pistone e tagliandola con un bisturi. Pesare ed estrarre il composto con acetonitrile, acqua, miscela TFA, 70% acetonitrile e 01% acido trifluoroacetico in un tubo Eppendorf da 1,5 millilitri. Centrifugare a 20XG per 30 minuti due volte per rimuovere il materiale insolubile e raccogliere il surnatante.
Registrare cromatogrammi rilevati dai raggi UV a 570 nanometri di rilevamento della loro forma chiusa e rilevamento a 270 nanometri della forma ad anello aperto. Utilizzare i campioni di controllo non irradiati e irradiati preparati in modo simile alle soluzioni madre negli esperimenti sulle cellule per determinare i tempi di ritenzione specifici e calibrare il metodo. Ripetere l'esperimento tre volte e tracciare la percentuale normalizzata di ciascuna fotoforma sul grafico, percentuale rispetto alla distanza dalla superficie del tessuto irradiato.
Al giorno zero, inoculare le femmine adulte C57 nere 6 topi del peso di circa 20 grammi ciascuna per via sottocutanea con una sospensione di circa mezzo milione di cellule di carcinoma polmonare di Lewis in circa 100 microlitri di DMEM e Matrigel mix nella zampa posteriore destra. Questa procedura viene eseguita sotto sedazione con isoflurano al 5%. Gli animali sono pronti per il trattamento nei giorni da cinque a otto, quando i tumori sono palpabili.
Tutte le operazioni che comportano il test devono essere eseguite in condizioni di semi-oscurità. Questa condizione vale anche quando si trattano gli animali dopo aver ricevuto la dose composta per un periodo di due giorni. Assemblare casualmente quattro gruppi di otto animali e rimuovere la pelliccia dall'area tumorale.
I due gruppi di controllo ricevono un'iniezione endovenosa del veicolo. 100 microlitri di soluzione salina per animale da 20 grammi, e gli animali nei due gruppi sperimentali hanno ricevuto il composto testato nella fotoforma inattiva in una soluzione di un milligrammo per millilitro di soluzione salina. Somministrare il bolo composto nella vena caudale a cinque millilitri per chilo.
Due ore e 45 minuti dopo l'iniezione del composto, irradiare l'area tumorale per 20 minuti in anestesia isoflurana con un laser a 650 nanometri, utilizzando una densità di potenza luminosa di 100 milliwatt per centimetro quadrato. Osservare attentamente le condizioni degli animali nei prossimi 30 minuti. Osserva quotidianamente gli animali e misura il loro peso e le dimensioni dei loro tumori.
Misurare i volumi del tumore e notare la progressione della necrosi. Determinare il tasso di sopravvivenza utilizzando la procedura standard. I risultati del nostro protocollo per la fase uno nel caso di esperimenti di coltura cellulare 2D possono essere presentati come immagini, come illustrato qui su un'immagine rappresentativa per cellule di carcinoma polmonare di Lewis incubate con LMB002 a diverse concentrazioni e per diversi periodi di incubazione.
Il costaining con Hoechst e ioduro di propidio consente la visualizzazione dei nuclei cellulari nel canale blu, fornendo così un conteggio totale delle cellule. Nel canale rosso sono state osservate cellule con integrità compromessa della membrana plasmatica. Supponendo che quest'ultimo sia necroticamente morto, l'apparente citotossicità di un composto in studio può essere quantificata come percentuale delle cellule positive allo ioduro di propidio.
I risultati della quantificazione dei dati ottenuti attraverso l'analisi automatizzata delle immagini sono mostrati qui. Per LMB002, si possono osservare dipendenze sigmoidali della percentuale di cellule positive allo ioduro di propidio nella concentrazione del composto. Da questi dati è possibile determinare i valori IC50.
Il nostro esperimento ha rivelato che la forma aperta di LMB002 è circa una fase di diluizione meno tossica del peptide prototipo, Gramicidina S, mentre la forma chiusa dimostra da tre a quattro fasi di diluizione una tossicità inferiore, che aumenta con il tempo di incubazione. Gli esperimenti sulle cellule 3D hanno prodotto lo stesso tipo di dati grezzi, le immagini sferoidi risolte a singola cellula una per parete. L'inclusione della calceina come terzo colorante colorante consente la quantificazione della frazione di cellule metabolicamente attive osservate nel canale verde.
Le curve dell'effetto dose, come quelle dell'esperimento 2D, sono state ottenute dalle pile di immagini Z-stack. Il pannello A illustra tali curve, confermando i risultati 2D. Come mostrato nel pannello B, il diametro sferoide complessivo varia con la concentrazione del composto.
L'esperimento per la fase due consente di determinare le concentrazioni di LMB002 in entrambe le fotoforme utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni rilevata dai raggi UV. Entrambe le fotoforme erano sufficientemente diverse nei tempi di ritenzione e assorbanza, mostrate integrate sui pannelli A e B della figura. I dati ottenuti sono riassunti in figura, confermando che la nostra sorgente di luce rossa induce la fotoconversione LMB002 ad anello chiuso ad una profondità fino a un centimetro nel tessuto surrogato, carne macinata a circa 103 milliwatt per centimetro quadrato.
I risultati dell'esperimento in vivo, fase tre della nostra metodologia, sono stati rappresentati da grafici che mostrano la crescita del tumore in funzione del tempo nelle curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier. La strategia qui rappresentata per valutare i candidati farmaci fotocommutabili è pratica e adatta per composti con fotointerruttori di tipo diariletene. La prima fase, la quantificazione della citotossicità può essere utilizzata per lo screening iniziale delle librerie dei composti fotocontrollati.
Fase due, la valutazione dell'efficienza di fotocommutazione è facile da configurare ed etica. Non richiede animali vivi. Fase tre, modelli fotofarmacologici in vivo, la terapia può essere applicata a piccoli animali.
