Photokontrollierte, biologisch aktive Verbindungen enthalten reversibel photoisomerisierbare Fragmente, Photoschalter in ihren Molekülen. Verbindungen sind zyklische Peptide, die durch ein Diarylethen-Fragment modifiziert werden, das reversible, lichtinduzierte elektrozyklische Transformationen durchläuft. Sie können photoschalten, d.h. zwischen einer UV-erzeugten, biologisch inaktiven Form und einer durch rotes Licht erzeugten, biologisch aktiven Form umschalten.
Es wird angenommen, dass photoschaltbare Medikamente sicherer sind als nicht photoschaltbare Medikamente. Das liegt daran, dass man dem menschlichen Körper eine ungiftige, deaktivierte Form verabreichen und sie nur dort lokal mit Licht aktivieren kann, wo man es braucht, also zum Beispiel bei Tumoren, Schnecken oder Wunden. Es gibt keine Standardmethoden oder -protokolle für die präklinische oder klinische Entwicklung solcher photopharmakologischen Medikamente, daher möchten wir Ihnen hier Experimente zeigen, die für diese frühe präklinische Forschung verwendet werden können.
Kateryna Horbatok und Tetiana Makhnii werden die Verfahren demonstrieren. Die Tierpflege- und Versuchsverfahren wurden von der Bioethikkommission der Firma Bienta genehmigt. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Puffer mithilfe von Standardverfahren.
Alternativ können Sie auch handelsübliche Lösungen verwenden. Bereiten Sie Stammlösungen von Verbindungen vor. Wiegen Sie für jede Verbindung zwei Chargen à 5,12 Milligramm der Masse in der ringgeschlossenen Fotoform in zwei 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen, eine mit klarer und eine mit schwarzen, undurchsichtigen Wänden.
Wiegen Sie als Positivkontrolle 2,28 Milligramm des nicht photokontrollierten Mutterpeptids in einem zusätzlichen Röhrchen. Fügen Sie jeder Probe 100 Mikroliter reines DMSO hinzu und wirbeln Sie 30 Sekunden lang. Photoisomerisieren Sie die Stammlösung in der durchsichtigen Röhre, indem Sie die Lösung mit einem 650-Nanometer-Laser bestrahlen, Lichtleistungsdichte 6 Watt pro Quadratzentimeter, mit Wirbeln, um das Mischen zu gewährleisten.
Fahren Sie fort, bis die Farbe von dunkelviolett zu hellbraun wechselt. Mit Alufolie vor Licht schützen. Säen Sie 5.000 bis 10.000 Zellen pro Well.
Wir verwendeten ca. 8.000 Lewis-Lungenkarzinomzellen in 200 Mikrolitern DMEM in den zentralen 60 Wells einer 96-Well-sterilen Platte mit klarem Boden und schwarzen, undurchsichtigen Wänden. Füllen Sie die restlichen 36 Vertiefungen mit reinem DMEM. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer 5%igen CO2-Atmosphäre.
Bereiten Sie am nächsten Tag serielle Verdünnungen von Verbindungen und die Positivkontrolle in autoklavierten Polypropylen-Klarsichtplatten vor. Beginnen Sie mit den Vorräten in DMSO und verdünnen Sie sie mit DMEM, aber überschreiten Sie nicht 1 % Volumen-DMSO in der höchsten Endkonzentration. Um eine unkontrollierte Photoisomerisierung der untersuchten Verbindungen zu verhindern, schalten Sie das Licht im Sterilschrank aus.
100 Mikroliter der Verdünnungen werden in 56 Vertiefungen mit 100 Mikrolitern zuvor zugesetztem DMEM überführt, um die erforderliche Endkonzentration der Verbindungen in den Vertiefungen zu erreichen, typischerweise im Bereich von fünf bis 150 Mikromolaren. Als nächstes werden 100 Mikroliter DMEM in vier Vertiefungen gegeben, die als Negativkontrolle dienen. Decken Sie die Platten mit Alufolie oder einer undurchsichtigen Kunststoffabdeckung ab, um ein unkontrolliertes Umschalten zu verhindern.
Legen Sie die Platten für die gewählte Inkubationszeit bei 37 Grad Celsius in einen Zellkultur-Inkubator. Geben Sie nach der Inkubation 50 Mikroliter Färbelösung pro Vertiefung auf die Platten. Verwenden Sie für dieses Experiment fünf Mikromolare Hoechst 33342 und Ein-Mikromolare Propidiumiodid als endgültige Färbelösungen.
Erneut bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren. Führen Sie eine automatisierte Fluoreszenzbildgebung mit einer Objektivlinse mit 20-facher Vergrößerung durch. Die Laborabläufe für diesen Teil der Methode sind identisch mit denen, die für das 2D-Experiment beschrieben werden: Vorbereitung der Zellkultur, Inkubation mit den getesteten Verbindungen und Bildgebung.
In diesem Fall werden die Zellen jedoch als kompakte, reife Sphäroide in einer 384-Well-U-Bodenplatte mit extrem geringer Adhäsion und schwarzen, undurchsichtigen Wänden hergestellt. Die Verwendung einer Platte dieser Größe ermöglicht es, zwei Verbindungen in einem Experiment zu vergleichen. In diesem Experiment haben wir zusätzlich Calcein AM als dritte Komponente der Multicolor-Färbelösung verwendet.
Die Bilder der 2D- und 3D-Experimente werden mit der automatisierten Bildanalysesoftware des Instruments analysiert. Zellen, die mit Hoechst- und Propidiumiodid-Farbstoffen kogefärbt wurden, gelten als nekrotisch tot, und ihr Anteil in Abhängigkeit von der Konzentration wird zur Berechnung des IC50-Wertes verwendet. Montieren Sie den optischen Zug für die Probenbestrahlung.
Es besteht aus einem optischen Kabel von der Laserlichtquelle, einer Linse mit variabler Brennweite, einer Spritze mit undurchsichtigem Deckel und einem flach geschnittenen Ende. Alle nachfolgenden Arbeiten müssen in einem abgedunkelten Raum mit minimaler Arbeitsplatzbeleuchtung durchgeführt werden. Bereiten Sie eine Modellgewebeprobe vor, die mit den inaktiven photoformalen Verbindungen beladen ist.
In einem typischen Durchlauf werden fünf Gramm frisches Schweinehackfleisch mechanisch mit der PBS-Lösung der Verbindung vermischt, um die Endkonzentration von 50 Milligramm pro Kilogramm zu erreichen. Füllen Sie die Spritze mit der geladenen Probe. Bestrahlen Sie die Probe im optischen Zug für die erforderliche Belichtungs- und Lichtdosiszeit.
Machen Sie nach der Belichtung vier Millimeter dicke Scheiben der Probe, indem Sie die Masse mit dem Kolben von der Spritze drücken und mit einem Skalpell schneiden. Wiegen und extrahieren Sie die Verbindung mit einem Gemisch aus Acetonitril, Wasser, TFA, 70 % Acetonitril und 01 % Trifluoressigsäure in einem 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen. Bei 20XG zweimal 30 Minuten lang zentrifugieren, um das unlösliche Material zu entfernen und den Überstand aufzufangen.
Zeichnen Sie UV-detektierte Chromatogramme mit einer 570-Nanometer-Detektion ihrer geschlossenen Form und einer 270-Nanometer-Detektion der ringoffenen Form auf. Verwenden Sie die unbestrahlten und bestrahlten Kontrollproben, die ähnlich wie die Stammlösungen in den Zellexperimenten hergestellt wurden, um die spezifischen Retentionszeiten zu bestimmen und die Methode zu kalibrieren. Wiederholen Sie das Experiment dreimal, und tragen Sie den normalisierten Prozentsatz jeder Fotoform im Diagramm auf, den Prozentsatz über den Abstand von der bestrahlten Gewebeoberfläche.
Am Tag Null werden die erwachsenen C57-Mäuse mit einem Gewicht von jeweils ca. 20 Gramm subkutan mit einer Suspension von ca. einer halben Million Lewis-Lungenkarzinomzellen in ca. 100 Mikrolitern DMEM- und Matrigel-Mischung im rechten Hinterbein geimpft. Dieses Verfahren wird unter 5%iger Isofluran-Sedierung durchgeführt. Die Tiere sind am fünften bis achten Tag bereit für die Behandlung, wenn die Tumore tastbar sind.
Alle Operationen, bei denen getestet wird, sollten unter halbdunklen Bedingungen durchgeführt werden. Diese Bedingung gilt auch für die Behandlung der Tiere, nachdem sie die zusammengesetzte Dosis über einen Zeitraum von zwei Tagen erhalten haben. Stellen Sie nach dem Zufallsprinzip vier Gruppen von acht Tieren zusammen und entfernen Sie das Fell aus dem Tumorbereich.
Die beiden Kontrollgruppen erhalten eine intravenöse Injektion des Vehikels. 100 Mikroliter Kochsalzlösung pro 20-Gramm-Tier, und die Tiere der beiden Versuchsgruppen erhielten die getestete Verbindung in der inaktiven Photoform in einer Lösung von einem Milligramm pro Milliliter Kochsalzlösung. Verabreichen Sie den zusammengesetzten Bolus mit fünf Millilitern pro Kilo in die Schwanzvene.
Zwei Stunden und 45 Minuten nach der Injektion des Präparats wird das Tumorgebiet 20 Minuten lang unter Isofluran-Narkose mit einem 650-Nanometer-Laser mit einer Lichtleistungsdichte von 100 Milliwatt pro Quadratzentimeter bestrahlt. Beobachten Sie den Zustand der Tiere in den nächsten 30 Minuten sorgfältig. Beobachten Sie die Tiere täglich und messen Sie ihr Gewicht und die Größe ihrer Tumore.
Messen Sie das Tumorvolumen und notieren Sie das Fortschreiten der Nekrose. Bestimmen Sie die Überlebensrate mit dem Standardverfahren. Die Ergebnisse unseres Protokolls für Schritt eins im Falle von 2D-Zellkulturexperimenten können als Bilder dargestellt werden, wie hier auf einem repräsentativen Bild für Lewis-Lungenkarzinomzellen, die mit LMB002 in unterschiedlichen Konzentrationen und für verschiedene Inkubationszeiträume inkubiert wurden.
Die Cofärbung mit Hoechst und Propidiumiodid ermöglicht die Visualisierung von Zellkernen im Blaukanal und liefert so eine Gesamtzellzahl. Zellen mit beeinträchtigter Integrität der Plasmamembran wurden im roten Kanal beobachtet. Unter der Annahme, dass letzteres nekrotisch tot ist, kann die scheinbare Zytotoxizität einer untersuchten Verbindung als Prozentsatz der Propidiumiodid-positiven Zellen quantifiziert werden.
Die Ergebnisse der Datenquantifizierung durch automatisierte Bildanalyse sind hier dargestellt. Für LMB002 sind sigmoidale Abhängigkeiten des Prozentsatzes von Propidiumiodid-positiven Zellen in der Verbindungskonzentration zu sehen. Aus diesen Daten können die IC50-Werte ermittelt werden.
Unser Experiment zeigte, dass die offene Form von LMB002 etwa einen Verdünnungsschritt weniger toxisch ist als der Prototyp des Peptids Gramicidin S, während die geschlossene Form eine um drei bis vier Verdünnungsschritte geringere Toxizität aufweist, die mit der Inkubationszeit zunimmt. Die 3D-Zellexperimente lieferten die gleiche Art von Rohdaten, die einzelzellaufgelösten Sphäroidbilder pro Wand. Die Zugabe von Calcein als dritter Färbefarbstoff ermöglicht die Quantifizierung des Anteils metabolisch aktiver Zellen, der im grünen Kanal beobachtet wird.
Die Dosis-Wirkungs-Kurven wurden, wie im 2D-Experiment, aus den Z-Stapeln von Bildern gewonnen. Abbildung A veranschaulicht solche Kurven und bestätigt die 2D-Ergebnisse. Wie in Abbildung B gezeigt, variiert der Gesamtdurchmesser des Sphäroids mit der Konzentration der Verbindung.
Das Experiment für Schritt zwei ermöglicht die Bestimmung der LMB002-Konzentrationen in beiden Photoformen mittels UV-detektierter Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Beide Fotoformen unterschieden sich hinreichend in Retentionszeiten und Absorption, integriert auf den Tafeln A und B der Abbildung. Die erhaltenen Daten sind in der Abbildung zusammengefasst und bestätigen, dass unsere Rotlichtquelle die ringgeschlossene LMB002-Photokonversion in einer Tiefe von bis zu einem Zentimeter im Gewebeersatz, Hackfleisch mit etwa 103 Milliwatt pro Quadratzentimeter, induziert.
Die Ergebnisse des In-vivo-Experiments, Schritt drei unserer Methodik, wurden durch Diagramme dargestellt, die das Tumorwachstum in Abhängigkeit von der Zeit in Kaplan-Meier-Überlebenskurven zeigten. Die hier vorgestellte Strategie zur Evaluierung photoschaltbarer Wirkstoffkandidaten ist praktikabel und eignet sich für Verbindungen mit Photoschaltern vom Diarylethen-Typ. Schritt eins, die Quantifizierung der Zytotoxizität, kann für das erste Screening der Bibliotheken der photokontrollierten Verbindungen verwendet werden.
Schritt zwei: Die Bewertung der Effizienz von Fotoschaltungen ist sowohl einfach einzurichten als auch ethisch vertretbar. Es werden keine lebenden Tiere benötigt. Schritt drei, in vivo photopharmakologische Modelle, kann die Therapie auf Kleintiere angewendet werden.
