El protocolo demostrado subrayó el enfoque experimental directo y efectivo y los pasos detallados para los efectos de la respuesta inmune de los nuevos adyuvantes virales. Este protocolo proporciona a la investigación no solo un método de evaluación básicamente inmune para la vacuna adyuvante, sino que también puede determinar su estabilidad masiva. Para comenzar, tome la solución de trabajo de 10 miligramos por mililitro de la proteína antígeno MRSA HI, y a ella, agregue secuencialmente los tres excipientes, miristato de isopropilo, aceite de ricino de polioxietileno y propilenglicol, manteniendo una relación de masa de uno es a seis es a tres.
Revuelva bien la mezcla, luego agregue gradualmente agua pura esterilizada para alcanzar un volumen del sistema de 10 mililitros. Para preparar la vacuna de nanoemulsión por el método de emulsificación de baja energía, revuélvala a 500 rotaciones por minuto y 25 grados centígrados durante aproximadamente 20 minutos. Posteriormente, la vacuna de nanoemulsión que contiene un miligramo por mililitro de proteína se obtiene como un líquido transparente transparente.
Para el recubrimiento de antígeno del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o placa ELISA, diluya el antígeno de la proteína HI a 10 microgramos por mililitro con solución de recubrimiento y agregue 100 microlitros del antígeno diluido por pocillo en la placa ELISA. Incubar el plato a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, lave la placa con 300 microlitros de PBST por pocillo.
Selle los pocillos con 300 microlitros de la solución de sellado por pocillo durante dos horas a 37 grados centígrados, luego diluya tres microlitros del suero de ratones de cada grupo experimental 100 veces agregando 297 microlitros de PBST y vortice el suero diluido. Agregue 100 microlitros de suero diluido por pocillo en la placa ELISA recubierta para cada muestra de suero. Del mismo modo, diluya los sueros de control positivo y negativo 100 veces con PBST agregando cuatro microlitros de suero de control positivo o negativo a 396 microlitros de PBST, seguido de una mezcla de vórtice.
Para realizar la dilución de doble proporción, agregue 200 microlitros del suero experimental previamente diluido a la primera fila de la placa ELISA recubierta, luego agregue 100 microlitros de PBST a todos los pocillos, excepto los de las filas uno y 12. A continuación, ajuste la pistola de pipetas a 100 microlitros y transfiera 100 microlitros de suero de la primera fila a la segunda fila que contiene PBST. Mezcle el contenido de la segunda fila 10 veces con la pipeta.
Del mismo modo, realizar una es a dos diluciones sucesivas del suero hasta la fila 11. Una vez hecho esto, deseche 100 microlitros de líquido de la fila 11. Agregue 100 microlitros de suero negativo y positivo diluido a cada pocillo correspondiente en la fila 12 siguiendo la plantilla de muestra.
Selle la placa ELISA con una envoltura de plástico e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Mientras tanto, diluya el anticuerpo secundario anti-ratón IgG HRP 10, 000 veces agregando PBST. Después de la incubación de una hora, lave la placa ELISA con 300 microlitros de PBST por pocillo para limpiar los anticuerpos no unidos, luego agregue 100 microlitros del anticuerpo secundario diluido a cada pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados durante 40 minutos.
Lave la placa con 300 microlitros de PBST por pocillo, luego agregue 100 microlitros de solución de desarrollo de color TMB a cada pocillo. Coloque las placas a 37 grados centígrados y lejos de la luz durante 10 minutos. Después de lo cual, termine la reacción inmediatamente con 50 microlitros de dos molares de ácido sulfúrico.
Detecte la densidad óptica o los valores de OD a 415 nanómetros utilizando un marcador enzimático dentro de los 15 minutos posteriores a la terminación. Las características físicas de la nueva vacuna de nanoemulsión se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión y microscopía de fuerza atómica. Se utilizó la dispersión dinámica de la luz para determinar la distribución del tamaño de partícula y el potencial zeta de la muestra.
SDS-PAGE y western blotting mostraron que la cantidad de antígeno en el precipitado y el sobrenadante no difirió significativamente después de la centrifugación, lo que indica que la vacuna estaba estructuralmente intacta, específica e inmunogénica. La vacuna adyuvante de nanoemulsión aumentó significativamente los títulos totales de anticuerpos IgG, IgG1 e IgG2a de los ratones. La inmunogenicidad de la vacuna proteica mejoró significativamente.
Los valores séricos de IgG2b OD a 450 nanómetros fueron más altos cuando se utilizó PBS a una dilución de uno es a 5, 000. El modelo letal de ratones MRSA 252 reflejó que la vacuna de nanoemulsión mostró un buen efecto protector e inhibió eficazmente la infección bacteriana con MRS A 252, mejorando la tasa de supervivencia de los ratones infectados. La preparación de la nanoemulsión y la adición de suero a la planta son los más importantes.
Además, cuando se detecta el título de anticuerpos, se debe prestar atención a corregir a una salida más amplia y líquida. Además de los adyuvantes, este método también se puede utilizar para la evolución inmune de otras matrices matemáticas, como plásticos o sistemas de entrega.
