O protocolo demonstrado sublinhou a abordagem experimental direta e eficaz e os passos detalhados para os efeitos da resposta imune de novos adjuvantes virais. Esse protocolo fornece à pesquisa não apenas um método basicamente de avaliação imunológica para a vacina adjuvante, mas também pode determinar sua estabilidade de massa. Para começar, pegue a solução de trabalho de 10 miligramas por mililitro da proteína do antígeno MRSA HI e, a ela, adicione sequencialmente os três excipientes, miristato de isopropilo, óleo de rícino de polioxietileno e propilenoglicol, mantendo uma relação de massa de um é para seis é para três.
Mexa bem a mistura e, aos poucos, adicione água pura esterilizada até atingir um volume de 10 mililitros. Para preparar a vacina de nanoemulsão pelo método de emulsificação de baixa energia, agite-a a 500 rotações por minuto e 25 graus Celsius por aproximadamente 20 minutos. Posteriormente, a vacina de nanoemulsão contendo um miligrama por mililitro de proteína é obtida como um líquido transparente claro.
Para o revestimento antigênico do ensaio imunoenzimático ou placa ELISA, dilua o antígeno da proteína HI para 10 microgramas por mililitro com solução de revestimento e adicione 100 microlitros do antígeno diluído por poço na placa de ELISA. Incube a placa a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação, lavar a placa com 300 microlitros de PBST por poço.
Selar os poços com 300 microlitros da solução de vedação por poço por duas horas a 37 graus Celsius, diluir três microlitros do soro de camundongos de cada grupo experimental 100 vezes adicionando 297 microlitros de PBST e vortexar o soro diluído. Adicionar 100 microlitros de soro diluído por poço na placa ELISA revestida para cada amostra de soro. Da mesma forma, diluir os soros controle positivo e negativo 100 vezes com PBST adicionando quatro microlitros de soro controle positivo ou negativo a 396 microlitros de PBST, seguido de mistura de vórtices.
Para realizar a diluição de dupla proporção, adicionar 200 microlitros do soro experimental previamente diluído à primeira fileira da placa ELISA revestida e, em seguida, adicionar 100 microlitros de PBST a todos os poços, exceto aqueles nas fileiras um e 12. Em seguida, ajuste a pistola de pipeta para 100 microlitros e transfira 100 microlitros de soro da primeira fileira para a segunda fileira contendo PBST. Misture o conteúdo na segunda fileira 10 vezes usando a pistola de pipeta.
Da mesma forma, realizar uma diluição do soro até a linha 11. Feito isso, descarte 100 microlitros de líquido da linha 11. Adicionar 100 microlitros de soro negativo e positivo diluído a cada poço correspondente na linha 12 após o modelo de amostra.
Sele a placa ELISA com filme plástico e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Enquanto isso, diluir o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo HRP 10.000 vezes adicionando PBST. Após a incubação de uma hora, lave a placa de ELISA com 300 microlitros de PBST por poço para limpar os anticorpos não ligados, adicione 100 microlitros do anticorpo secundário diluído a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por 40 minutos.
Lave a placa com 300 microlitros de PBST por poço e, em seguida, adicione 100 microlitros de solução de desenvolvimento de cor TMB a cada poço. Coloque as placas a 37 graus Celsius e longe da luz por 10 minutos. Depois disso, terminar a reação imediatamente com 50 microlitros de ácido sulfúrico de dois molares.
Detectar a densidade óptica ou valores OD em 415 nanômetros usando um marcador enzimático dentro de 15 minutos após o término. As características físicas da nova vacina em nanoemulsão foram analisadas usando microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de força atômica. O espalhamento dinâmico de luz foi utilizado para determinar a distribuição granulométrica e o potencial zeta da amostra.
SDS-PAGE e western blotting mostraram que a quantidade de antígeno no precipitado e sobrenadante não diferiu significativamente após a centrifugação, indicando que a vacina estava estruturalmente intacta, específica e imunogênica. A vacina adjuvante em nanoemulsão aumentou significativamente os títulos totais de anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a dos camundongos. A imunogenicidade da vacina proteica melhorou significativamente.
Os valores séricos de IgG2b OD a 450 nanômetros foram mais altos quando PBS foi usado em uma diluição de um é a 5.000. O modelo letal de camundongos MRSA 252 refletiu que a vacina em nanoemulsão mostrou um bom efeito protetor e inibiu efetivamente a infecção bacteriana por MRS A 252, melhorando a taxa de sobrevivência dos camundongos infectados. A preparação de nanoemulsão e a adição de soro à planta são as mais importantes.
Além disso, quando detectada o título de anticorpos, deve-se prestar atenção para corrigir para uma saída mais ampla e baseada em líquido. Além de adjuvantes, esse método também pode ser usado para a evolução imunológica de outras matrizes matemáticas, como plásticos ou sistemas de entrega.
