הפרוטוקול שהודגם הדגיש את הגישה הניסויית הישירה והיעילה ואת הצעדים המפורטים להשפעות התגובה החיסונית של אדג'ובנטים נגיפיים חדשים. פרוטוקול זה מספק למחקר לא רק שיטת הערכה חיסונית בסיסית לחיסון אדג'ובנטי, אלא גם יכול לקבוע את יציבות המסה שלהם. כדי להתחיל, לקחת את 10 מיליגרם למיליליטר פתרון עבודה של חלבון אנטיגן MRSA HI, ואליו, להוסיף ברצף את שלושת excipients, isopropyl myristate, שמן קיק פוליאוקסאתילן, פרופילן גליקול, שמירה על יחס מסה של אחד הוא לשישה הוא לשלושה.
מערבבים היטב את התערובת, ואז מוסיפים בהדרגה מים טהורים מעוקרים כדי להגיע לנפח מערכת של 10 מיליליטר. כדי להכין את החיסון ננו-תחליב בשיטת תחליב אנרגיה נמוכה, ערבבו אותו במהירות של 500 סיבובים לדקה ו-25 מעלות צלזיוס במשך כ-20 דקות. לאחר מכן, חיסון ננו-תחליב המכיל מיליגרם אחד לחלבון מיליליטר מתקבל כנוזל שקוף שקוף.
עבור ציפוי אנטיגן של אנזים מקושר immunosorbent assay או צלחת ELISA, לדלל אנטיגן חלבון HI ל 10 מיקרוגרם למיליליטר עם תמיסת ציפוי, ולהוסיף 100 מיקרוליטר של אנטיגן מדולל לכל באר בצלחת ELISA. דוגרים על הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת עם 300 מיקרוליטר של PBST לכל באר.
אטמו את הבארות עם 300 מיקרוליטר של תמיסת האיטום לכל באר למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן דללו שלושה מיקרוליטרים של נסיוב העכברים מכל קבוצת ניסוי 100 פעמים על ידי הוספת 297 מיקרוליטר של PBST, וערברו את הסרום המדולל. הוסף 100 מיקרוליטר של סרום מדולל לכל באר בצלחת ELISA המצופה עבור כל דגימת סרום. באופן דומה, דללו את סרומי הבקרה החיוביים והשליליים 100 פעמים עם PBST על ידי הוספת ארבעה מיקרוליטרים של סרום בקרה חיובי או שלילי ל-396 מיקרוליטר של PBST, ולאחר מכן ערבוב מערבולות.
כדי לבצע דילול יחס כפול, הוסף 200 מיקרוליטר של סרום ניסיוני מדולל בעבר לשורה הראשונה של צלחת ELISA מצופה, ולאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של PBST לכל הבארות, למעט אלה בשורות 1 ו -12. לאחר מכן, להתאים את אקדח פיפטה ל 100 מיקרוליטר ולהעביר 100 מיקרוליטר של סרום מהשורה הראשונה לשורה השנייה המכילה PBST. מערבבים את התוכן בשורה השנייה 10 פעמים באמצעות אקדח פיפטה.
באופן דומה, לבצע אחד הוא לשני דילולים רצופים של הסרום עד שורה 11. לאחר שתסיים, השליכו 100 מיקרוליטר נוזל משורה 11. הוסף 100 מיקרוליטר של סרום שלילי וחיובי מדולל לכל באר מתאימה בשורה 12 לאחר תבנית הדגימה.
אטמו את צלחת ELISA בניילון נצמד ודגרו בחום של 37 מעלות למשך שעה. בינתיים, לדלל נוגדנים משניים נגד עכבר IgG HRP 10, 000 פעמים על ידי הוספת PBST. לאחר הדגירה של שעה, לשטוף את צלחת ELISA עם 300 מיקרוליטר של PBST לכל באר כדי לנקות את הנוגדנים unbound, ולאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל לכל באר לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות.
לשטוף את הצלחת עם 300 מיקרוליטר של PBST לכל באר, ולאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של פתרון פיתוח צבע TMB לכל באר. מניחים את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס הרחק מהאור במשך 10 דקות. לאחר מכן, לסיים את התגובה מיד עם 50 מיקרוליטר של שתי חומצה גופרתית מולרית.
זהה את הצפיפות האופטית או ערכי OD ב- 415 ננומטר באמצעות סמן אנזים תוך 15 דקות לאחר הסיום. המאפיינים הפיזיים של חיסון ננו-תחליב חדשני נותחו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת ומיקרוסקופ כוח אטומי. פיזור אור דינמי שימש לקביעת התפלגות גודל החלקיקים ופוטנציאל הזטה של הדגימה.
SDS-PAGE ו-Western Blotting הראו כי כמות האנטיגן במשקע ובסופרנאטנט לא פחתה באופן משמעותי לאחר הצנטריפוגה, מה שמצביע על כך שהחיסון היה שלם מבחינה מבנית, ספציפי ואימונוגני. החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב הגדיל משמעותית את סך טיטרי הנוגדנים IgG, IgG1 ו-IgG2a של העכברים. האימונוגניות של החיסון החלבוני השתפרה משמעותית.
ערכי OD IgG2b בסרום ב 450 ננומטר היו הגבוהים ביותר כאשר PBS שימש בדילול אחד הוא 5, 000. המודל הקטלני של עכברי MRSA 252 שיקף כי החיסון נגד ננו-תחליב הראה אפקט מגן טוב ועיכב ביעילות זיהום חיידקי עם MRS A 252, מה ששיפר את שיעור ההישרדות של עכברים נגועים. הכנת ננו-תחליב והוספת סרום לצמח הם החשובים ביותר.
כמו כן, כאשר מזהים את טיטר הנוגדנים, יש לשים לב לתקן ליציאה רחבה ונוזלית. מלבד אדג'ובנטים, שיטה זו יכולה לשמש גם לאבולוציה חיסונית של מערכים מתמטיים אחרים, כגון פלסטיק או מערכות מסירה.
