评估纳米乳剂佐剂疫苗对耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌 （MRSA）感染的免疫反应

所展示的方案强调了直接有效的实验方法以及新型病毒佐剂免疫反应效果的详细步骤。该方案不仅为研究提供了佐剂疫苗的基本免疫评估方法，还可以确定其质量稳定性。首先，取每毫升10毫克的MRSA HI抗原蛋白工作溶液，依次加入三种赋形剂，肉豆蔻酸异丙酯，聚氧乙烯蓖麻油和丙二醇，保持质量比为一至六为三。

充分搅拌混合物，然后逐渐加入灭菌的纯水，以达到10毫升的系统体积。为了通过低能量乳化法制备纳米乳化疫苗，请以每分钟500转和25摄氏度的速度搅拌约20分钟。随后，将含有每毫升1毫克蛋白质的纳米乳疫苗制成透明液体。

对于酶联免疫吸附测定或ELISA板的抗原包被，用包被溶液将HI蛋白抗原稀释至每毫升10微克，并在ELISA板中每孔加入100微升稀释的抗原。将板在四摄氏度下孵育过夜。孵育后，每孔用300微升PBST洗涤板。

用每孔300微升密封溶液在37摄氏度下密封孔2小时，然后通过加入297微升PBST将每个实验组的3微升小鼠血清稀释100倍，并涡旋稀释的血清。对于每个血清样品，在包被的 ELISA 板中每孔加入 100 μL 稀释的血清。同样，将4微升阳性或阴性对照血清加入396微升PBST中，用PBST稀释阳性和阴性对照血清100倍，然后涡旋混合。

要进行双倍比例稀释，将200微升先前稀释的实验血清添加到包被的ELISA板的第一行中，然后向所有孔中加入100微升PBST，除了第一行和第12行的孔。接下来，将移液器枪调节至100微升，并将100微升血清从第一行转移到含有PBST的第二行。使用移液枪将第二行的内容物混合 10 次。

类似地，执行一次是连续两次稀释血清直到第 11 行。完成后，从第 100 行丢弃 11 微升液体。按照样品模板，将 100 μL 稀释的阴性和阳性血清添加到第 12 行的每个相应孔中。

用保鲜膜密封ELISA板，并在37摄氏度下孵育一小时。同时，通过加入PBST稀释抗小鼠IgG HRP二抗10， 000倍。孵育一小时后，每孔用300微升PBST洗涤ELISA板以清洁未结合的抗体，然后在每个孔中加入100微升稀释的二抗，并将板在37摄氏度下孵育40分钟。

每孔用300微升PBST清洗板，然后向每个孔中加入100微升TMB显色溶液。将板放在 37 摄氏度下并远离光线 10 分钟。之后，立即用50微升两摩尔硫酸终止反应。

在终止后 15 分钟内使用酶标记物检测 415 纳米处的光密度或 OD 值。采用透射电子显微镜和原子力显微镜分析了新型纳米乳疫苗的物理特性。使用动态光散射来确定样品的粒径分布和zeta电位。

SDS-PAGE和蛋白质印迹显示，离心后沉淀物和上清液中的抗原量没有明显延迟，表明疫苗结构完整、特异性和免疫原性。纳米乳佐剂疫苗显著提高了小鼠的总IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度。蛋白质疫苗的免疫原性显著提高。

当PBS以1至5， 000稀释度使用时，450纳米处的血清IgG2b OD值最高。MRSA 252小鼠的致死模型反映，纳米乳疫苗表现出良好的保护作用，有效抑制MRS A 252的细菌感染，提高了感染小鼠的存活率。纳米乳液的制备和向植物中添加血清是最重要的。

另外，在检测抗体滴度的地方，应注意纠正较宽和液基。除了佐剂，这种方法还可用于其他数学阵列的免疫进化，如塑料或输送系统。