Gösterilen protokol, doğrudan ve etkili deneysel yaklaşımın ve yeni viral adjuvanların immün yanıt etkilerine yönelik ayrıntılı adımların altını çizdi. Bu protokol, araştırmaya sadece adjuvan aşı için temel bir immün değerlendirme yöntemi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kütle stabilitesini de belirleyebilir. Başlamak için, MRSA HI antijen proteininin mililitre çalışma çözeltisi başına 10 miligramını alın ve buna sırayla üç yardımcı maddeyi, izopropil miristanı, polioksietilen hint yağını ve propilen glikolü ekleyin, bir kütle oranını koruyarak altıya üçe kadardır.
Karışımı iyice karıştırın, ardından 10 mililitrelik bir sistem hacmine ulaşmak için yavaş yavaş sterilize saf su ekleyin. Nanoemülsiyon aşısını düşük enerjili emülsifikasyon yöntemiyle hazırlamak için, dakikada 500 rotasyonda ve yaklaşık 20 dakika boyunca 25 santigrat derecede karıştırın. Daha sonra, mililitre protein başına bir miligram içeren nanoemülsiyon aşısı, berrak şeffaf bir sıvı olarak elde edilir.
Enzime bağlı immünosorbent testinin veya ELISA plakasının antijen kaplaması için, HI protein antijenini kaplama çözeltisi ile mililitre başına 10 mikrograma seyreltin ve ELISA plakasındaki kuyucuk başına 100 mikrolitre seyreltilmiş antijen ekleyin. Plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, plakayı kuyucuk başına 300 mikrolitre PBST ile yıkayın.
Kuyucukları, 37 santigrat derecede iki saat boyunca kuyu başına 300 mikrolitre sızdırmazlık çözeltisi ile kapatın, daha sonra 297 mikrolitre PBST ekleyerek her deney grubundan üç mikrolitre fare serumunu 100 kez seyreltin ve seyreltilmiş serumu vorteks. Her serum numunesi için kaplanmış ELISA plakasına kuyucuk başına 100 mikrolitre seyreltilmiş serum ekleyin. Benzer şekilde, 396 mikrolitre PBST'ye dört mikrolitre pozitif veya negatif kontrol serumu ekleyerek pozitif ve negatif kontrol serumlarını PBST ile 100 kez seyreltin, ardından vorteks karıştırma yapın.
Çift oranlı seyreltme yapmak için, kaplanmış ELISA plakasının ilk sırasına daha önce seyreltilmiş deneysel serumun 200 mikrolitresini ekleyin, ardından birinci ve 12. sıradakiler hariç tüm kuyucuklara 100 mikrolitre PBST ekleyin. Ardından, pipet tabancasını 100 mikrolitreye ayarlayın ve 100 mikrolitre serumu ilk sıradan PBST içeren ikinci sıraya aktarın. Pipet tabancasını kullanarak ikinci sıradaki içeriği 10 kez karıştırın.
Benzer şekilde, 11. sıraya kadar serumun iki ardışık seyreltmesinden birini gerçekleştirin. İşiniz bittiğinde, 11. satırdan 100 mikrolitre sıvı atın. Örnek şablonu izleyerek satır 12'deki her bir karşılık gelen kuyucuğa 100 mikrolitre seyreltilmiş negatif ve pozitif serum ekleyin.
ELISA plakasını plastik ambalajla kapatın ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu arada, ikincil antikor anti-fare IgG HRP'yi PBST ekleyerek 10.000 kez seyreltin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, bağlanmamış antikorları temizlemek için ELISA plakasını kuyucuk başına 300 mikrolitre PBST ile yıkayın, ardından her bir oyuğa seyreltilmiş ikincil antikorun 100 mikrolitresini ekleyin ve plakayı 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Plakayı kuyucuk başına 300 mikrolitre PBST ile yıkayın, ardından her bir kuyucuğa 100 mikrolitre TMB renk geliştirme çözeltisi ekleyin. Plakaları 37 santigrat dereceye ve 10 dakika boyunca ışıktan uzağa yerleştirin. Bundan sonra, reaksiyonu derhal 50 mikrolitre iki molar sülfürik asit ile sonlandırın.
Sonlandırmadan sonraki 15 dakika içinde bir enzim işaretleyici kullanarak 415 nanometrede optik yoğunluğu veya OD değerlerini tespit edin. Yeni nanoemülsiyon aşısının fiziksel özellikleri, transmisyon elektron mikroskobu ve atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak analiz edildi. Numunenin partikül boyutu dağılımını ve zeta potansiyelini belirlemek için dinamik ışık saçılması kullanıldı.
SDS-PAGE ve batı lekelenmesi, çökelti ve süpernatanttaki antijen miktarının santrifüjlemeden sonra önemli ölçüde ertelenmediğini, aşının yapısal olarak sağlam, spesifik ve immünojenik olduğunu gösterdi. Nanoemülsiyon adjuvan aşısı, farelerin toplam IgG, IgG1 ve IgG2a antikor titrelerini önemli ölçüde arttırdı. Protein aşısının immünojenitesi önemli ölçüde iyileşti.
450 nanometredeki serum IgG2b OD değerleri, PBS bir tanesinde 5.000 seyreltmede kullanıldığında en yüksekti. MRSA 252 farelerinin ölümcül modeli, nanoemülsiyon aşısının iyi bir koruyucu etki gösterdiğini ve MRS A 252 ile bakteriyel enfeksiyonu etkili bir şekilde inhibe ettiğini ve enfekte olmuş farelerin hayatta kalma oranını artırdığını yansıttı. Nanoemülsiyonun hazırlanması ve bitkiye serum eklenmesi en önemlisidir.
Ayrıca, antikor titresinin tespit edildiği yerlerde, daha geniş ve sıvı bazlı bir çıkışa doğru düzeltmeye dikkat edilmelidir. Adjuvanların yanı sıra, bu yöntem plastikler veya dağıtım sistemleri gibi diğer matematik dizilerinin bağışıklık evrimi için de kullanılabilir.
