Le protocole démontré soulignait l’approche expérimentale directe et efficace et les étapes détaillées des effets de réponse immunitaire des nouveaux adjuvants viraux. Ce protocole fournit à la recherche non seulement une méthode d’évaluation essentiellement immunitaire pour les vaccins adjuvants, mais peut également déterminer leur stabilité de masse. Pour commencer, prenez la solution de travail de 10 milligrammes par millilitre de la protéine antigénique SARM HI, et y ajoutez séquentiellement les trois excipients, le myristate d’isopropyle, l’huile de ricin de polyoxyéthylène et le propylène glycol, en maintenant un rapport massique de un est à six est à trois.
Bien mélanger le mélange, puis ajouter progressivement de l’eau pure stérilisée pour atteindre un volume de système de 10 millilitres. Pour préparer le vaccin à nanoémulsion par une méthode d’émulsification à basse énergie, agitez-le à 500 rotations par minute et 25 degrés Celsius pendant environ 20 minutes. Par la suite, le vaccin à nanoémulsion contenant un milligramme par millilitre de protéine est obtenu sous forme de liquide transparent clair.
Pour le revêtement antigénique du dosage immuno-enzymatique ou de la plaque ELISA, diluer l’antigène de la protéine HI à 10 microgrammes par millilitre avec une solution d’enrobage et ajouter 100 microlitres de l’antigène dilué par puits dans la plaque ELISA. Incuber la plaque à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, laver la plaque avec 300 microlitres de PBST par puits.
Sceller les puits avec 300 microlitres de solution d’étanchéité par puits pendant deux heures à 37 degrés Celsius, puis diluer trois microlitres de sérum de souris de chaque groupe expérimental 100 fois en ajoutant 297 microlitres de PBST et vorter le sérum dilué. Ajouter 100 microlitres de sérum dilué par puits dans la plaque ELISA enduite pour chaque échantillon de sérum. De même, diluez les sérums témoins positifs et négatifs 100 fois avec du PBST en ajoutant quatre microlitres de sérum témoin positif ou négatif à 396 microlitres de PBST, suivi d’un mélange de vortex.
Pour effectuer une dilution à double rapport, ajoutez 200 microlitres du sérum expérimental préalablement dilué à la première rangée de la plaque ELISA revêtue, puis ajoutez 100 microlitres de PBST à tous les puits, à l’exception de ceux des rangées un et 12. Ensuite, réglez le pistolet à pipette à 100 microlitres et transférez 100 microlitres de sérum de la première rangée à la deuxième rangée contenant du PBST. Mélangez le contenu de la deuxième rangée 10 fois à l’aide du pistolet à pipette.
De même, on effectue une telle à deux dilutions successives du sérum jusqu’à la rangée 11. Une fois cela fait, jetez 100 microlitres de liquide de la rangée 11. Ajouter 100 microlitres de sérum négatif et positif dilué à chaque puits correspondant de la ligne 12 en suivant le modèle d’échantillon.
Scellez la plaque ELISA avec une pellicule plastique et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant ce temps, diluez l’anticorps secondaire anti-souris IgG HRP 10 000 fois en ajoutant PBST. Après l’incubation d’une heure, laver la plaque ELISA avec 300 microlitres de PBST par puits pour nettoyer les anticorps non liés, puis ajouter 100 microlitres de l’anticorps secondaire dilué à chaque puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes.
Lavez la plaque avec 300 microlitres de PBST par puits, puis ajoutez 100 microlitres de solution de développement de couleur TMB à chaque puits. Placez les plaques à 37 degrés Celsius et à l’abri de la lumière pendant 10 minutes. Après quoi, terminez immédiatement la réaction avec 50 microlitres d’acide sulfurique molaire.
Détecter la densité optique ou les valeurs OD à 415 nanomètres à l’aide d’un marqueur enzymatique dans les 15 minutes suivant la terminaison. Les caractéristiques physiques d’un nouveau vaccin à nanoémulsion ont été analysées à l’aide de la microscopie électronique à transmission et de la microscopie à force atomique. La diffusion dynamique de la lumière a été utilisée pour déterminer la distribution granulométrique et le potentiel zêta de l’échantillon.
SDS-PAGE et Western blot ont montré que la quantité d’antigène dans le précipité et le surnageant ne différait pas significativement après la centrifugation, ce qui indique que le vaccin était structurellement intact, spécifique et immunogène. Le vaccin adjuvant à base de nanoémulsion a augmenté de manière significative les titres totaux d’anticorps IgG, IgG1 et IgG2a des souris. L’immunogénicité du vaccin protéique a été considérablement améliorée.
Les valeurs sériques d’IgG2b OD à 450 nanomètres étaient les plus élevées lorsque le PBS était utilisé à une dilution de 5 000. Le modèle létal de souris SARM 252 a montré que le vaccin à nanoémulsion a montré un bon effet protecteur et inhibait efficacement l’infection bactérienne par MRS A 252, améliorant ainsi le taux de survie des souris infectées. La préparation de nanoémulsions et l’ajout de sérum à la plante sont les plus importants.
En outre, lors de la détection du titre d’anticorps, il faut faire attention à corriger à une sortie plus large et à base liquide. Outre les adjuvants, cette méthode peut également être utilisée pour l’évolution immunitaire d’autres réseaux mathématiques, tels que les plastiques ou les systèmes d’administration.
