En 1988, Richard Lenski comenzó un experimento de evolución. Llenó 12 frascos Erlenmeyer con un medio de crecimiento definido limitado por glucosa conocido como DM25. Inoculó seis de estos frascos con una cepa de E. coli conocida como REL606 que no puede utilizar la arabinosa de azúcar como nutriente.
Estas poblaciones fueron designadas A-1 a A-6. Inoculó a los otros seis con una cepa casi idéntica conocida como REL607 que es capaz de utilizar arabinosa. Estas cepas ancestrales, la E. coli que evolucionó a partir de ellas, se pueden distinguir cuando se colocan en tetrazolio o agar arabinosa.
Las cepas Ara-forman colonias rojas, y las cepas Ara+strains forman colonias blancas. Lenski colocó estos matraces en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados, lo que les permitió crecer hasta la saturación y agotar la glucosa en el medio. En este punto, transfirió el 1% del cultivo de cada uno de los matraces a un nuevo conjunto de 12 frascos que contenían medio fresco.
Estos ciclos diarios de transferencia y rebrote han continuado durante décadas, creando una larga historia de evolución que puede ser estudiada por los investigadores. En nuestro protocolo, describimos cómo el experimento de evolución a largo plazo, o LTEE, las poblaciones se transfieren y cultivan cada día. Luego describimos cómo las poblaciones son revisadas regularmente para detectar posibles signos de contaminación y archivadas para proporcionar un registro congelado permanente para su posterior estudio.
A menudo nos referimos a esto como el, cito, registro fósil del LTEE. Una forma importante en que el tempo general y el carácter de los cambios evolutivos se monitorean en el LTEE es a través de la medición de las aptitudes relativas de las poblaciones y cepas del experimento. Describimos cómo llevar a cabo estos ensayos de competencia de cocultura y analizamos los datos resultantes para calcular los valores de aptitud relativa.
Mostraremos el primero y el último de estos procedimientos en este video. Primero, demostraremos una transferencia diaria del experimento de evolución a largo plazo. Desinfecte la superficie sobre la que se realizarán las transferencias de LTEE limpiándola con etanol al 70% o una solución de lejía al 10%.
Encienda un mechero Bunsen para crear una corriente ascendente local y permitir la llama de la cristalería. Preparar 13 matraces Pyrex Erlenmeyer de 50 mililitros tapados con vasos de precipitados Pyrex o polipropileno de 20 mililitros que hayan sido lavados y esterilizados en autoclave. Revise los frascos en busca de residuos visibles y reemplace los que no estén perfectamente limpios.
Etiquete seis frascos A-1 a A-6 con un marcador rojo, y los otros seis frascos A+1 a A+6 con un marcador negro. Etiquetar el último matraz restante, que será el blanco, con la fecha, en formato mes-día, y el día de la semana. Llenar cada uno de los 13 matraces con 9,9 mililitros de medio DM25 utilizando una pipeta serológica estéril de 10 mililitros.
Encender la boca de cada matraz después de retirar el vaso de precipitados que sirve de tapa, y antes de reemplazar el vaso de precipitados. Encender la punta de la pipeta entre el llenado de cada matraz. Retire los frascos LTEE del día anterior de la incubadora de agitación.
Examine cada uno a su vez sosteniéndolo hacia la luz para evaluar su turbidez y color. Verifique la integridad del matraz y busque la presencia de materias extrañas. Con una micropipeta P200 con punta filtrante estéril, transferir 100 microlitros de cultivo de cada matraz LTEE al matraz correspondiente que contenga DM25 fresco.
Comience con A-1, luego transfiera A + 1. Después de eso, continúe alternando entre las poblaciones menos y más. Para realizar un seguimiento de qué culturas se han transferido, cambie los frascos hacia la izquierda como pipeteo desde o hacia ellos.
Observe una técnica aséptica estricta durante las transferencias. Utilice una punta de pipeta nueva para cada transferencia. Encienda las bocas de los frascos inmediatamente después de destapar y antes de recapitular, y limpie el barril y el inyector de la micropipeta con un Kimwipe humedecido con etanol al 70% entre cada transferencia.
Incubar los matraces recién inoculados a 37 grados centígrados durante 24 horas con una agitación orbital de 120 revoluciones por minuto sobre un diámetro de una pulgada. Almacene los cultivos del día anterior a cuatro grados centígrados. Retenga estas culturas durante dos días.
Deseche las culturas más antiguas que se salvaron a cuatro grados centígrados tres días antes en este momento. Introduzca la hora, la fecha, el número de transferencia, su nombre o iniciales, si las referencias culturales estaban bien o no, y cualquier otra información relevante en el cuaderno del registro de transferencias. Otras 6 2/3 generaciones han pasado en la historia del experimento de evolución a largo plazo con E. coli.
Si hay algún problema, accidente o sospecha de contaminación con los cultivos LTEE del día anterior, no se transfiera de ellos. En su lugar, almacene todo el conjunto de 12 cultivos a cuatro grados centígrados para su posterior examen y caracterización adicional. Recupere los matraces de respaldo que se transfirieron desde el día anterior y se almacenaron a cuatro grados centígrados.
Colóquelos en la mesa de trabajo para que se calienten a temperatura ambiente. Agitar suavemente cada matraz para resuspender las células. Transfiera de cada matraz a un medio fresco en un nuevo juego de matraces y continúe el experimento normalmente.
Anote en el registro de transferencia que utilizó las referencias culturales de copia de seguridad y registre el mismo número de transferencia que el día anterior. Si se observa contaminación en los matraces de respaldo almacenados a cuatro grados centígrados, entonces las poblaciones afectadas de LTEE deben reiniciarse a partir de existencias congeladas. A continuación, demostraremos un ensayo de competencia de cocultivo que se puede usar para medir la aptitud relativa de dos cepas o poblaciones del experimento de evolución a largo plazo.
Mostraremos un experimento de competencia que evoluciona tanto de los ancestros LTEE, REL606 y 607, como de dos poblaciones evolucionadas, población A-5 a 20.000 generaciones, REL8597; y población A+5 a 20.000 generaciones, REL8604. Estos ensayos utilizaron una replicación séxtuple para cada par de un competidor Ara-y Ara+. Decida cuántas cepas y/o poblaciones LTEE de la competencia utilizará y cuántos ensayos de competencia replicados se realizarán para cada par de competidores.
Prepare los suministros necesarios de la siguiente manera. Para el día de reactivación, día menos dos, llene un matraz Erlenmeyer estéril de 50 mililitros tapado con un vaso de precipitados de 20 mililitros con 9,9 mililitros de DM1000 o caldo de lisogenia, LB, por cepa o población de E. coli que se utilizará como competidor. Llenar un matraz más con 9,9 mililitros del mismo medio para que sirva como un blanco no inoculado.
Para el día de preacondicionamiento, día menos uno, llene un tubo de ensayo con 9,9 mililitros de solución salina estéril al 0,85% de peso por volumen por competidor, dos matraces con 9,9 mililitros de DM25 por ensayo de réplica entre un par de competidores, y un matraz más con 9,9 mililitros de DM25 para un espacio en blanco. Para el día en que comience la competencia, día cero, llene un matraz con 9,9 mililitros de DM25, llene un tubo de ensayo con 9,9 mililitros de solución salina estéril y prepare una placa de tetrazolio o arabinosa, o TA, por ensayo de competición replicado. Llene un matraz más con 9,9 mililitros de DM25 para que sirva como espacio en blanco.
Si está realizando una competencia de tres días, llene dos juegos adicionales de frascos de competencia. Para el último día de la competencia, llene dos tubos de ensayo con 9.9 mililitros de solución salina estéril y prepare una placa TA por réplica de competencia. En el día menos dos de un experimento de competencia, revive a los competidores por separado de las existencias congeladas.
Retire los crioviales que contienen las existencias congeladas de las cepas competidoras del congelador de 80 grados centígrados. Mantenga los viales fríos en un buen cubo mientras los usa. Después de que cada stock congelado se descongele, vórtice completamente para resuspender las células de E. coli.
Si revive un clon, inocular el matraz que contiene medio fresco con 12 microlitros del caldo congelado. Si revive una población, inocule con 120 microlitros del stock congelado. Incubar los matraces de avivamiento en el espacio en blanco a 37 grados centígrados durante la noche con una sacudida orbital de 120 revoluciones por minuto sobre un diámetro de una pulgada.
En el día menos uno de un experimento de competencia, precondiciona a los competidores por separado en DM25. Saque de la incubadora los frascos que contienen los cultivos de competidores revividos. Transfiera 100 microlitros de cada matraz al tubo de ensayo de solución salina para ese competidor.
Mezclar cada tubo de dilución a fondo justo antes de transferir 100 microlitros del cultivo diluido a un matraz con DM25 fresco. Inocular dos de estos matraces de preacondicionamiento para cada ensayo de réplica, uno para cada uno de los competidores. Incubar los matraces de preacondicionamiento en el blanco a 37 grados centígrados durante 24 horas.
En el día cero de un experimento de competencia, comienzas la competencia mezclando los competidores y el plato para los recuentos iniciales. Saque los frascos de preacondicionamiento de la incubadora. Transfiera 50 microlitros del competidor de Ara al primer matraz de competición de réplica lleno de DM25 fresco.
Transfiera inmediatamente 50 microlitros del competidor Ara+ al mismo matraz de competición. Mezclar el matraz agitando suavemente. Repita estos pasos para combinar todas las réplicas de todos los pares de competidores que estaba probando.
Transfiera 100 microlitros de cada matraz de competición recién inoculado al tubo de ensayo de solución salina etiquetado para ese ensayo de competición replicado. Coloque los nuevos frascos de competición y los espacios en blanco en la incubadora agitadora. Mientras tanto, el mismo día, haga un vórtice a fondo cada tubo de ensayo y coloque 80 microlitros de estas diluciones de 10, 000 veces en placas TA.
Etiquete el lado de la parte inferior de cada placa con el par de cepas que se mezclaron, el número de réplica y el día cero para indicar que se utilizará para determinar la representación inicial de cada competidor. Incubar las placas TA boca abajo en una incubadora de convección por gravedad a 37 grados centígrados hasta que las colonias de los competidores Ara-y Ara+ sean visibles y distinguibles. Generalmente, esto ocurre dentro de 16 a 24 horas, pero puede tomar más tiempo para algunas cepas evolucionadas.
Cuente el número de colonias Ara-rojo y Ara+blanco en cada placa y registre los resultados. Si está realizando una competencia de tres días, transfiera 100 microlitros de cada competencia replicados a 9.9 mililitros de medio DM25 fresco en un matraz nuevo después del crecimiento. Incubar estos frascos del primer día durante 24 horas.
Realizar otra transferencia de la misma manera e incubar los frascos del día dos durante 24 horas para completar tres ciclos completos de crecimiento de cocultivo de los competidores en condiciones LTEE. El último día de la competencia, el día uno o el tercer día, dependiendo de la duración de su experimento, preparará el plato para los recuentos finales. Saque los frascos de competición de la incubadora.
Transfiera 100 microlitros de cada matraz de competición al primer tubo de ensayo de solución salina para que se repita. Vortex cada tubo de dilución de 100 veces para mezclarlo bien y transferir 100 microlitros al segundo tubo de solución salina para que se repita. Los tubos resultantes contienen diluciones de 10.000 veces de los cultivos DM25.
Vortex cada tubo de ensayo que contiene una dilución de 10, 000 veces a fondo y placa 80 microlitros de ella en una placa TA. Etiquete el lado de la parte inferior de cada plato con el par de cepas que se mezclaron, el número de réplica y el primer día para una competencia de un día o el día tres para una competencia de tres días para indicar que se utilizará para determinar la representación final de cada competidor. Incubar las placas de TA a 37 grados centígrados y contar las colonias Ara-y Ara+ después del crecimiento.
Utilice la hoja de cálculo de Excel proporcionada con este protocolo, o el paquete Fitness RR, para calcular la condición relativa de las cepas en su competición y trazar los resultados. Durante las transferencias diarias del experimento de evolución a largo plazo, la densidad de los cultivos después del crecimiento es muy baja y a menudo debe juzgarse sosteniendo un cultivo justo al lado de un espacio en blanco. La excepción es la población A-3 que ha evolucionado para usar citrato en el medio como fuente adicional de nutrientes y crece hasta aproximadamente diez veces la densidad celular de las otras poblaciones.
Las mediciones de la densidad óptica en los cultivos LTEE también se pueden utilizar para controlar el crecimiento esperado. Para los ensayos de competencia de ejemplo, esperamos que un competidor más apto aumente su representación con el tiempo, en relación con un competidor menos apto. El examen de las placas de TA con colonias cultivadas a partir de diluciones de una sola réplica de la competencia entre las dos cepas ancestrales muestra que la proporción permanece relativamente constante en el transcurso de un experimento de competencia de tres días.
Por el contrario, la población A + 5 supera rápidamente al ancestro REL606. Y la población A-5 supera rápidamente al antepasado REL607. Las dos poblaciones evolucionadas están casi igualadas.
Las representaciones de colonias rojas y blancas siguen siendo casi las mismas durante los tres días de la competencia. Usando los recuentos de colonias después de un día de cocultivo, encontramos que las aptitudes de las poblaciones evolucionadas han aumentado en un 60% durante el LTEE en relación con las cepas ancestrales de E. coli. Al continuar transfiriendo las competiciones durante varios días, podemos mejorar la precisión de las mediciones de aptitud relativa para los competidores que están muy igualados.
Pero cuando dos competidores tienen aptitudes muy diferentes, ya no hay una representación adecuada de ambas colonias después de una competencia de varios días para calcular la aptitud relativa. Los métodos que demostramos aquí son críticos para estudiar el registro histórico único del LTEE y para continuar este experimento de evolución abierta. También pueden proporcionar un punto de partida para otros que están considerando nuevos experimentos de evolución que abordan nuevas preguntas, usan nuevos entornos y estudian diferentes microorganismos.
