Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NFSC 82101224 a YG)

Todos los experimentos con animales fueron aprobados (No. 2021-847) por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Xi'an Jiaotong.
1. Esterilización y preparación del material
<ol><li>Esterilice las herramientas de disección mediante desinfección con vapor a alta temperatura y alta presión y séquelas en una incubadora a 50 °C durante la noche.</li>
	<li>Preparar 100 ml del medio de cultivo que contenga un 10 % de suero fetal bovino (FBS) y 10 mg/ml de penicilina/estreptomicina (añadir 10 ml de FBS y 10 μl de solución madre de penicilina a 90 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (EMEM)) con antelación y conservar a 4 °C.</li>
</ol>2. Disección y extirpación del hueso temporal para la recogida de epitelios auditivos
<ol><li>Sacrificar un total de 10 ratones recién nacidos (con edades comprendidas entre P3 y P5) mediante decapitación en hielo. Utilice una metodología alternativa, éticamente aprobada, si es necesario.</li>
	<li>Mantenga la cabeza en su lugar, abra el cuero cabelludo a lo largo de la sutura sagital con unas tijeras microquirúrgicas y separe y fije el cuero cabelludo bilateralmente con los dedos, como se muestra en la Figura 1A.</li>
	<li>Extirpar el cerebro con un pequeño elevador perióstico y dividir en dos la parte basal del cráneo. Corta el cráneo con unas tijeras y voltea hacia adelante para abrir el cráneo; Usa la punta de las tijeras para raspar el cerebro y exponer la base del cráneo.</li>
	<li>Observar los huesos temporales bilaterales en la base del cráneo (Figura 1C). Use tijeras para cortar la base del cráneo a lo largo de la línea media, raspe la piel y elimine cualquier hueso innecesario (Figura 1D, D').</li>
	<li>Retenga y transfiera los huesos temporales a placas de Petri estériles de 35 mm que contengan solución salina balanceada de Hank (HBSS) fresca (Figura 1E).</li>
	<li>Use dos pinzas de punta #5 para extraer la bulla y el tejido circundante de la porción petrosa del hueso temporal (Figura 1E). NOTA: En esta etapa, el laberinto óseo en el hueso temporal de los ratones no estaría completamente calcificado y se diseccionaría fácilmente con fórceps.</li>
	<li>Sostenga las pinzas con una mano para fijar la parte semicircular del hueso temporal y coloque la parte inferior del pie de las pinzas en el nicho redondo de la ventana con la otra mano para separar el hueso lateral de la cóclea del vestíbulo de la escala. Retire con cuidado la porción petrosa del hueso temporal sin tocar el epitelio OC. Posteriormente, separe y retire cuidadosamente el laberinto óseo de la cóclea desde el extremo basal hasta el extremo apical (Figura 1F).</li>
	<li>Microaísle cuidadosamente el órgano del epitelio sensorial de Corti del modiolo con pinzas de #5 puntas (Figura 1G).</li>
	<li>Sujete el ligamento espiral, sepárelo cuidadosamente de la estría vascular con pinzas microquirúrgicas y transfiera el epitelio auditivo limpio a una placa de cultivo estéril de 3 mm que contenga HBSS utilizando una pipeta de 200 μL (Figura 1H).</li>
	<li>Recoja 20 muestras de cada animal y transfiéralas rápidamente a una placa de Petri estéril de 100 mm que contenga HBSS para el siguiente paso de preparación (Figura 1).</li>
</ol>3. Desagregación enzimática para la obtención de células ciliadas auditivas
<ol><li>Transfiera el epitelio auditivo a 10 ml de DMEM fresco que contenga tripsina al 0,25% e incube a 37 °C durante 12 min.</li>
	<li>Con una punta de pipeta de 200 μL, separe suavemente las células ciliadas de la lámina basal y otras células bajo un microscopio quirúrgico.</li>
	<li>Añadir otros 10 mL de medio de cultivo para inhibir la disgregación.</li>
	<li>Filtrar las células suspendidas en el medio de cultivo a través de un filtro de 70 μm, recoger el filtrado en un tubo limpio de 50 ml y centrifugarlo a 300 × g durante 5 min.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células ciliadas en al menos 5 ml de medio de cultivo pipeteándolas suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 1.000 μl. Evite introducir burbujas.</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos en el fondo de una placa de seis pocillos con anticipación. Cuente las células y cultívelas a una densidad de 10a 6 células/ml en placas de seis pocillos.</li>
	<li>Cultivar las células adherentes en 2 mL de DMEM (que contiene 10% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) a 37 °C y 5% de CO2. Cambia el medio de cultivo todos los días. NOTA: Cabe mencionar que el uso de este protocolo no da como resultado la obtención de células ciliadas puras. Basándonos en este método de cultivo celular primario, recomendamos utilizar células d2 o d3 para estudios posteriores, ya que las células ciliadas pueden constituir aproximadamente el 70% de las células en cultivo y estar en buen estado.</li>
</ol>4. Tinción inmunofluorescente
<ol><li>Coseche las células cultivadas de d1 a d6 (un pocillo por día). Aspire el medio de cultivo y enjuague las células 2 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Fije las celdas con paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Retire el fijador y enjuague las celdas durante 3 x 3 minutos con PBS.</li>
	<li>Permeabilizar las células con PBS que contenga Triton X-100 al 0,2% durante 10 min en RT.</li>
	<li>Incubar las células permeabilizadas con una solución de bloqueo que consiste en 10% de FBS en PBS durante 20 min a RT.</li>
	<li>Tiñir las células con un anticuerpo monoclonal anti-miosina (diluido a 1:200 en PBS) a 4 °C durante la noche.</li>
	<li>Lavar las células 3 veces con PBS estéril e incubarlas con anticuerpo secundario (Alexa Fluor 594 cabra anti-conejo MYO7A, diluido 1:500 en PBS) y faloidina marcada con fluoresceína (Alexa Fluor 488, para identificar la estructura celular) durante 2 h en RT.</li>
	<li>Enjuague las células 3 veces con PBS para eliminar los anticuerpos secundarios.</li>
	<li>Agregue 1-2 gotas de medio de montaje con DAPI en los portaobjetos, monte los cubreobjetos y colóquelos debajo de un microscopio confocal de barrido láser para capturar fotos de las células.</li>
</ol>5. Análisis estadístico
<ol><li>Realizar un análisis de varianza bidireccional (ANOVA) seguido de las pruebas post hoc de Tukey para analizar los cambios en los valores de gris de miosina-VIIa y faloidina a lo largo del tiempo. Utilice el método de marcado de letras para marcar las diferencias estadísticas.</li>
	<li>Realice ANOVAs unidireccionales adicionales seguidas de las pruebas post-hoc de Tukey para comparar la proporción de células positivas para faloidina entre muestras celulares del día 1 al día 6 y la proporción de células positivas para miosina VII en los mismos días.</li>
</ol>

Cultivo eficiente in vitro de células ciliadas cocleares de ratón

<ol>
	<li>Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+structural+development+of+mammalian+Basilar+Membrane+provides+anatomical+basis+for+the+maturation+of+tonotopic+maps+and+frequency+tuning.">Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning.</a> Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).</li><li>Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+hair+cells:+The+sound-sensing+machines.">Cochlear hair cells: The sound-sensing machines.</a> FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).</li><li>Joo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Contribution+of+Ototoxic+Medications+to+Hearing+Loss+Among+Older+Adults.">The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).</li><li>Nieman, C. L., Oh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+Loss.">Hearing Loss.</a> Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).</li><li>Mao, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Hearing+Loss:+Updates+on+Molecular+Targets+and+Potential+Interventions.">Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions.</a> Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).</li><li>Morioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+vulnerability+after+noise+exposure+in+a+mouse+model+of+reactive+oxygen+species+overproduction.">Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction.</a> J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cytological+profiling+of+biological+aging+of+mouse+cochlear+inner+and+outer+hair+cells.">Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells.</a> Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Culture+of+Neonatal+Murine+Inner+Ear+Explants.">Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants.</a> Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).</li><li>Ding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+ototoxicity+in+rat+cochlear+organotypic+cultures.">Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures.</a> Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).</li><li>Abitbol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+ototoxicity+in+organotypic+cochlear+cultures+occurs+independent+of+gap+junctional+intercellular+communication.">Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-VIIa+is+expressed+in+multiple+isoforms+and+essential+for+tensioning+the+hair+cell+mechanotransduction+complex.">Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex.</a> Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).</li><li>Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+auditory+HEI-OC1+cells.">Working with auditory HEI-OC1 cells.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+cochlear+progenitors+that+develop+hair+and+supporting+cells+in+the+organ+of+Corti.">Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti.</a> Nat Commun. 8, 15046 (2017).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells.">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).</li><li>Ruel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+SLC17A8+encoding+vesicular+glutamate+transporter-3,+VGLUT3,+underlies+nonsyndromic+deafness+DFNA25+and+inner+hair+cell+dysfunction+in+null+mice.">Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice.</a> Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).</li><li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3.">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+Atoh1+enhancers+cooperate+for+sound+receptor+hair+cell+development.">Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).</li><li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity.">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

En comparación con la línea celular HEI-OC1, los cultivos primarios de células ciliadas replicaron con mayor precisión el estado fisiológico de las células in vivo. Por lo tanto, el método de cultivo primario auditivo establecido mediante el aislamiento de células vivas de los órganos cocleares y su cultivo inmediato parece ser una herramienta valiosa para la investigación exhaustiva de los sistemas auditivos. Ciertas técnicas son cruciales para una cultura exitosa. En primer lugar, minimizar la duración de l...

Las células ciliadas cocleares desempeñan un papel importante en la detección del sonido y la transmisión de señales al nervio auditivo. Las células ciliadas son células mecanicistas que funcionan como receptores sensoriales primarios y convierten las vibraciones sonoras en señales eléctricas en los vertebrados. El epitelio sensorial del oído interno de los mamíferos comprende una sola fila de células ciliadas internas y tres filas de células ciliadas externas. En diferentes áreas básicas de membrana, las células ciliadas perciben sonidos a diferentes frecuencias (entre 20 y 2.000 Hz)1. La función de las células ciliadas externas es un proceso de amplificación mecánica activa que ayuda a afinar el oído interno de los mamíferos, confiriendo una alta sensibilidad al sonido. Las células ciliadas internas son responsables de detectar los sonidos. Después de la despolarización graduada, la información acústica se transmite al cerebro através de las fibras nerviosas auditivas.
La pérdida de audición puede ser causada por defectos genéticos, envejecimiento, traumatismos por ruido o el uso excesivo de medicamentos ototóxicos, que constituyen un importante problema de salud en todo el mundo 3,4. La pérdida de audición se debe principalmente a un daño irreversible en las células ciliadas5. Con respecto a la pérdida de audición inducida por ruido, aunque los investigadores han llegado a un consenso sobre varios detalles de su etiología, se carece de una comprensión completa de los numerosos mecanismos subyacentes. Las células ciliadas externas son particularmente vulnerables a la sobreexposición acústica6. Las células ciliadas cocleares mecanosensibles están implicadas en la pérdida de audición relacionada con la edad; Sin embargo, los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la degeneración de las células ciliadas siguen siendo desconocidos. Varios cambios en los procesos moleculares conducen al envejecimiento de las células ciliadas, al estrés oxidativo, a la respuesta al daño del ADN, a la autofagia y a la desregulación de la expresión y transcripción de genes relacionados con la especialización de las células ciliadas.
Como el oído interno está encerrado en el hueso temporal, en lo profundo del hueso más duro del cuerpo, es experimentalmente inaccesible, lo que supone un reto para las investigaciones sobre los mecanismos de reparación y regeneración de las células ciliadas. Por lo tanto, el establecimiento de cultivos in vitro para investigar la función de las células ciliadas se ha convertido en un método ideal para la investigación de los mecanismos de regeneración y lesión del oído interno. Los procedimientos para la preparación de cultivos organotípicos cocleares han sido descritos en estudios previos 8,9,10. Investigadores de todo el mundo han empleado diversas técnicas de microdisección coclear y preparación de superficies. A pesar de los desafíos persistentes, se han establecido con éxito varios sistemas de cultivo primario de células ciliadas in vitro. Los cultivos de órganos cocleares contienen varios tipos de células, incluidas las células ciliadas, las células de Deiters, las células de Hensen, las células pilares y las fibras del nervio auditivo. Una comprensión profunda de los cambios en las células ciliadas a nivel celular y molecular después de una lesión permitirá el desarrollo de herramientas de investigación más poderosas. Este estudio tuvo como objetivo demostrar los pasos para aislar órganos cocleares de ratones neonatos y separar enzimáticamente las células ciliadas abundantes para estudios in vitro. La naturaleza de las células cultivadas se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm BioLite cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Nunc cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well palate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>310109005</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>BD Company</td>
			<td>352350</td>
			<td>using for filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>A11008</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>day 3-5 neonatal murine&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>provided by Xi&#39;an Jiaotong University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>5#</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica anatomy microscope</td>
			<td>Germany</td>
			<td>S9i</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit plyclonal to Myosin VIIa</td>
			<td>Abcam company</td>
			<td>ab92996</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Belevor</td>
			<td>10cm/04.0524.10</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice

Las células ciliadas cocleares son los receptores sensoriales del sistema auditivo. Estas células se encuentran en el órgano de Corti, el órgano sensorial responsable de la audición, dentro del laberinto óseo del oído interno. Las células ciliadas cocleares consisten en dos tipos anatómica y funcionalmente distintos: células ciliadas externas e internas. El daño a cualquiera de ellos resulta en pérdida de audición. En particular, como las células ciliadas internas no pueden regenerarse y el daño a ellas es permanente. Por lo tanto, el cultivo in vitro de células ciliadas primarias es indispensable para investigar los efectos protectores o regenerativos de las células ciliadas cocleares. Este estudio tuvo como objetivo descubrir un método para aislar y cultivar células ciliadas de ratón. 
Tras la extracción manual de la pared lateral coclear, el epitelio auditivo se diseccionó meticulosamente del modiolo coclear al microscopio, se incubó en una mezcla compuesta por tripsina-EDTA al 0,25 % durante 10 min a 37 °C y se suspendió suavemente en medio de cultivo con una punta de pipeta de 200 μL. La suspensión celular se pasó a través de un filtro celular, el filtrado se centrifugó y las células se cultivaron en placas de 24 pocillos. Las células ciliadas se identificaron en función de su capacidad para expresar un complejo de mecanotransducción, la miosina-VIIa, que está implicada en las tensiones motoras, y mediante el marcaje selectivo de la F-actina mediante faloidina. Las células alcanzaron >90% de confluencia después de 4 d en cultivo. Este método puede mejorar nuestra comprensión de las características biológicas de las células ciliadas cultivadas in vitro y demostrar la eficiencia de los cultivos de células ciliadas cocleares, estableciendo una base metodológica sólida para futuras investigaciones auditivas.

Cochlear hair cells play important roles in sound detection and signal transmission to the auditory nerve. Hair cells are mechanistic cells that function as primary sensory receptors and convert sound vibrations into electrical signals in vertebrates. The sensory epithelium of the mammalian inner ear comprises a single row of inner hair cells and three rows of outer hair cells. In different basic membrane areas, hair cells perceive sounds at different frequencies (between 20 and 2,000 Hz)1. The function of outer hair cells is an active mechanical amplification process that helps fine-tune the mammalian inner ear, conferring high sensitivity to sound. Inner hair cells are responsible for detecting sounds. After graded depolarization, acoustic information is transmitted to the brain through the auditory nerve fibers2.
Hearing loss may be caused by genetic defects, aging, noise trauma, or the excessive use of ototoxic drugs, which constitute a major health concern worldwide3,4. Hearing loss mainly results from irreversible damage to hair cells5. Regarding noise-induced hearing loss, although researchers have reached a consensus on several details of its etiology, a comprehensive understanding of the numerous underlying mechanisms is lacking. Outer hair cells are particularly vulnerable to acoustic overexposure6. Mechanosensitive cochlear hair cells are involved in age-related hearing loss; however, the molecular and cellular mechanisms underlying hair cell degeneration remain unknown. Several changes in the molecular processes lead to hair cell aging, oxidative stress, DNA damage response, autophagy, and dysregulation of the expression and transcription of genes related to hair cell specialization7.
As the inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, it is experimentally inaccessible, posing a challenge to investigations into the mechanisms of hair cell repair and regeneration. Hence, establishing in vitro cultures for investigating the function of hair cells has become an ideal method for research on the regeneration and injury mechanisms of the inner ear. The procedures for preparing cochlear organotypic cultures have been described in earlier studies8,9,10. Investigators worldwide have employed various cochlear microdissection and surface preparation techniques. Despite the persistent challenges, various primary hair cell culture systems have been successfully established in vitro. Cochlear organ cultures contain various cell types, including hair cells, Deiters cells, Hensen&#39;s cells, pillar cells, and auditory nerve fibers. An in-depth understanding of the changes in hair cells at the cellular and molecular levels after injury will enable the development of more powerful research tools. This study aimed to demonstrate the steps for isolating cochlear organs from neonatal mice and enzymatically detaching the abundant hair cells for in vitro studies. The nature of the cultured cells was confirmed using immunofluorescence staining.

Autor destacado: Avances en el cultivo de células ciliadas de ratón para la investigación auditiva 

Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos

The inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, posing a challenging to investigations. The cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells.We demonstrate the steps for isolating cochlear organs from your natural mice and asymmetrically detaching the abundant hair cells for in-vitro studies. The nature of the cultured cells, was confirmed using immunofluorescence staining. There are three primary culture method established by isolating living cells from cochlear organs, and immediately coaching them, pair to be a valuable tool for extensive research, are all three system.This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in-vivo cultured hair cells, and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Siguiendo este protocolo, sembramos las células aisladas. Las semillas de células ciliadas cocleares primarias se consideraron exitosas si las células no flotaban en el medio de cultivo y se diseminaban dentro de las 24 h. Determinamos el número de células ciliadas después de que se adhirieron y se extendieron en agregados planos en el fondo del plato. Después de 1 día, las células ciliadas vivas se adhirieron firmemente al fondo de la placa de cultivo y las células no adherentes se eliminaron enjuagando con PB...

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En este artículo, presentamos un protocolo detallado para aislar y cultivar células ciliadas cocleares primarias de ratones. Inicialmente, el órgano de Corti se diseccionó de cócleas murinas neonatales (de 3 a 5 días de edad) bajo un microscopio. Posteriormente, las células se digierieron enzimáticamente en una suspensión unicelular y se identificaron mediante inmunofluorescencia después de varios días en cultivo.

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

El oído interno está encerrado en el hueso temporal, en lo profundo del hueso más duro del cuerpo, lo que representa un desafío para las investigaciones. El cultivo de células ciliadas primarias es indispensable para investigar las células ciliadas cocleares. Este estudio tuvo como objetivo descubrir un método para aislar y cultivar células ciliadas de ratón.Demostramos los pasos para aislar los órganos cocleares de sus ratones naturales y separar asimétricamente las células ciliadas abundantes para estudios in vitro. La naturaleza de las células cultivadas se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia. Hay tres métodos de cultivo primarios establecidos al aislar células vivas de los órganos cocleares e inmediatamente entrenarlas, emparejados para ser una herramienta valiosa para la investigación extensa, son los tres sistemas.Este método puede mejorar nuestra comprensión de las características biológicas de las células ciliadas cultivadas in vivo y demostrar la eficiencia de los cultivos de células ciliadas cocleares, estableciendo una base metodológica sólida para futuras investigaciones auditivas.

isolation-culture-primary-cochlear-hair-cells-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

1.6K vistas.  The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University. El oído interno está encerrado en el hueso temporal, en lo profundo del hueso más duro del cuerpo, lo que representa un desafío para las investigaciones. El cultivo de células ciliadas primarias es indispensable para investigar las células ciliadas cocleares. Este estudio tuvo como objetivo descubrir un método para aislar y cultivar células ciliadas de ratón.Demostramos los pasos para aislar los órganos cocleares de sus ratones naturales y separar asimétricamente las célula...

Video: Autor destacado: Avances en el cultivo de células ciliadas de ratón para la investigación auditiva 

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Investigación

Biología

Dissection and Removal of the Temporal Bone to Collect Auditory Epithelia from Newborn Mice

To begin, securely hold the head of the euthanized newborn mice in place. Using micro operating scissors, open the scalp along the sagittal suture. Then, separate and immobilize the scalp bilaterally with the fingers.Use scissors to sever the cranium and flip it forward to access the skull. Employ a small periosteal elevator to extract the brain and then use the tip of the scissors to gently scrape the brain, revealing the base of the skull. Now, examine the bilateral temporal bones at the skull's base.Employ scissors to incise the base of the skull along the midline. Then, scrape off the skin and eliminate any unnecessary bone. Preserve and transfer the temporal bones to 35-millimeter sterile Petri dishes filled with fresh HBSS.Next, use a pair of 5 number pointed forceps to eliminate the bola and surrounding tissue from the petrous portion of the temporal bone. Hold the forceps with one hand to stabilize the semi-circular part of the temporal bone. Use the other hand to insert the lower tip of the forceps into the round window niche, separating the lateral bone of the cochlea from the scale of vestibule.Carefully remove the petrous portion of the temporal bone without contacting the Organ of Corti epithelium. Then, meticulously detach and extract the bony labyrinth of the cochlea, starting from the basal to the apical end. Using 5 number pointed forceps, carefully micro isolate the sensory epithelium of the Organ of Corti from the modiolus.Next, employ micro-operating forceps to hold the spiral ligament, and gently separate it from the stria vascularis. Transfer the clean auditory epithelium, using a 200 microliter pipette, to a three millimeter sterile culture dish containing HBSS. Place the isolated auditory epithelium in a 100 millimeter sterile Petri dish filled with HBSS for the subsequent preparation steps.

Disección y extirpación del hueso temporal para recoger epitelios auditivos de ratones recién nacidos

Enzymatic Disaggregation of the Auditory Epithelium to Obtain Auditory Hair Cells

To begin, isolate the auditory epithelium from the temporal bone of newborn mice and transfer it to 10 milliliters of fresh DMEM containing 0.25%Trypsin, incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 12 minutes. Using a 200 microliter pipette tip, gently separate the hair cells from the basal lamina and other cells using an operating microscope. Then add another 10 milliliters of culture medium to inhibit the disaggregation.Filter the suspended cells through a 70 micrometer filter. Collect the filtrate in a clean 50 milliliter tube and centrifuge it at 300G for five minutes. Using a 1000 microliter pipette tip, re suspend the hair cells in five milliliters of culture medium by gentle pipetting.Now place a cover slip at the bottom of a six well plate in advance. Count the cells and culture them at 10 to the sixth cells per milliliter density in the six well plate, grow the adherence cells in two milliliters of DMEM at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After one day of culturing the hair cells adhered firmly to the bottom of the dish.By the third day, the number of cells had doubled.