Las herramientas de edición genómica basadas en CRISPR han facilitado enormemente la producción de modelos de representación modificados genéticamente. El sistema CRISPR está compuesto por un único complejo de ARN guía a una nucleasa Cas9 y puede programarse para dirigirse a una secuencia de interés dentro del genoma para crear una ruptura de ADN de doble cadena. A través de la entrega conjunta de una plantilla de reparación de ADN, esta rotura de ADN se puede restaurar con precisión junto con la adición de cualquier secuencia de ADN diseñada deseada a través de un proceso llamado reparación dirigida por homología.
Es mediante este proceso que podemos generar modelos de ratas knock-in con inserciones o sustituciones de ADN específicas. Utilizando este protocolo, presentamos un enfoque modificado que utiliza virus adenoasociados para administrar una plantilla de reparación de ADN a embriones de rata, junto con una posterior administración de complejos CRISPR Cas9 a través de la electroporación de dos embriones celulares. Los serotipos 1 o 6 de AAV están empaquetados con una plantilla de reparación de ADN diseñada para integrarse en el genoma de la rata a través del proceso de reparación dirigida por homología mediada por CRISPR.
El AAV se añade a una gota de 30 microlitros de medio KSOM de rata a una concentración final de 3 X 10 a la séptima copia del genoma por microlitro. A continuación, los embriones recién recolectados en una etapa celular con pronúcleos visibles se transfieren a los medios que contienen AAV, lo que permite que ocurra la transducción viral. Con nuestro protocolo, no hay necesidad de adelgazar la zona pelúcida, ya que los serotipos 1 y 6 de AAV pueden pasar fácilmente para una entrega eficiente de la plantilla de reparación del ADN.
Los embriones se cultivan con el AAV durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y humedad máxima. Al día siguiente, se elabora una mezcla de electroporación que contiene cien nanogramos por microlitro de ARN guía único y cien nanogramos por microlitro de proteína Cas9 diluida en medios OptiMIM. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la formación de complejos CRISPR RNP.
Durante el tiempo de incubación, se enciende el electroporador y se conectan los cables a los electrodos de portaobjetos de vidrio. Una vez completada la formación de RNP, se pipetean cinco microlitros de mezcla de electroporación entre los electrodos, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la solución. Los embriones, ahora en la etapa de dos células, se extraen del medio que contiene AAV y se trasladan cuidadosamente a la mezcla de electroporación entre los electrodos.
Los embriones están alineados, asegurándose de que ninguno toque ninguno de los electrodos, ya que esto provocará lisis durante la electroporación. Aquí hay una vista de este procedimiento a través del microscopio. También es importante tener en cuenta que la impedancia disminuirá a medida que aumente el volumen entre los electrodos.
Por esta razón, y para no diluir la mezcla de electroporación, se debe transferir un mínimo de medios junto con los embriones. A continuación, se mide la impedancia pulsando el botón con un símbolo de ohmios. La impedancia debe estar dentro del rango de 0,18 a 0,3 ohmios.
Si está dentro del rango, la electroporación se inicia presionando el botón de inicio. Este proceso solo toma un par de segundos, y así es como se ve a través del microscopio. Notará que se forman burbujas rápidamente en cada electrodo.
Inmediatamente después de la electroporación, los embriones se recogen del portaobjetos de vidrio y se lavan tres veces en medios KSOM de rata frescos. Luego, los embriones pueden cultivarse para estudios in vitro o transferirse a hembras sustitutas para producir descendencia viva. Es importante tener en cuenta que la hinchazón del embrión es común después de la electroporación.
Esta hinchazón debería desaparecer después de unas horas de cultivo. También es común ver eventos de fusión celular en hasta el 20% de los embriones de dos células después de la electroporación. Por lo general, la fusión celular se puede evitar mediante una cuidadosa alineación del eje horizontal de los embriones entre los electrodos.
Probar nuestro protocolo en embriones de rata y cribar blastocitos cultivados para la inserción de una secuencia corta de intrones artificiales diseñada que contiene dos sitios loxP. Observamos que más del 60% de los blastocistos contienen el alelo knock-in correctamente dirigido según el análisis de secuencia de próxima generación. A continuación, probando más a fondo nuestro protocolo para producir ratas knock-in vivas, diseñamos un proyecto para diseñar una secuencia de recubrimiento de recombinasa Cre dirigida al sitio de inicio de ATG del gen DRD2 de la rata.
De los 11 descendientes nacidos, 10 fueron positivos en el análisis de PCR en el grupo de homología de cinco primos, tres primos de homología y un ensayo de PCR interno para detectar la recombinasa Cre. Como resumen de siete proyectos diferentes, hemos logrado una tasa media de éxito del 76% en animales fundadores, según lo determinado por el análisis de PCR en las uniones de los brazos de homología y la verificación de la secuencia de ADN. Utilizando esta entrega de ADN mediada por AAV y la tubería de electroporación de embriones de dos células, hemos experimentado eficiencias de knock-in significativamente más altas que los enfoques tradicionales para inserciones de ADN de hasta tres KB de longitud.
También es importante tener en cuenta que, si bien demostramos el uso de este procedimiento en embriones de rata, también se puede aplicar de manera efectiva a otras especies para generar inserciones de ADN dirigidas.
