Este método podría verificar los ARN guía en embriones, probar preguntas tempranas del desarrollo o crear ratones editados. Cualquier avance en CRISPR Cas9 podría usarse con este método. La principal ventaja de este método es que es fácil de aprender y utiliza reactivos que están disponibles para los laboratorios que tienen acceso a ratones.
En el futuro, esta técnica sería útil para corregir una enfermedad o mutación en la descendencia de un animal de compañía o animal importante para la agricultura. Este método es el más adecuado para generar modelos de ratón. En nuestro laboratorio, hemos estado utilizando variaciones de este método para investigar los eventos que rodean la fertilización y el desarrollo temprano de la preimplantación, específicamente, la regulación génica en la potencia embrionaria.
La parte más desafiante es usar la aguja de vidrio para mover embriones de una placa a otra. Demostrando este procedimiento estará Chantal Diallo, especialista en investigación en mi laboratorio. Para comenzar la recolección y el procesamiento de embriones, coloque el ratón hembra sacrificado en su espalda y rocíe etanol al 70% en el abdomen para abrirlo quirúrgicamente.
Para abrir la cavidad abdominal y eliminar los oviductos, corte la capa de piel con tijeras quirúrgicas y localice los ovarios. A continuación, extirpe quirúrgicamente ambos oviductos, ubicados proximales a los ovarios, y colóquelos en gotas individuales de 50 microlitros de M2 más medio BSA. Bajo un microscopio estéreo, use pinzas de disección para cortar la ampolla del oviducto para liberar los complejos cúmulo-ovocitos, o AOC, que contienen ovocitos, luego, para evitar el arrastre de desechos, transfiera y combine cada cúmulo-ovocito a una sola gota de 50 microlitros de M2 más BSA con una pipeta con mango ajustada a 20 a 30 microlitros.
A continuación, para eliminar las células cúmulos de los cigotos, transfiera los AOC con un poco de medio adicional a una gota de M2 de 100 microlitros más hialuronidasa y mezcle suavemente con pipeteo hasta que los embriones estén visiblemente separados de las células cúmulos mucho más pequeñas. Para diluir la hialuronidasa y eliminar las células sueltas del cúmulo, use una pipeta operada por la boca para mover los cigotos a una gota fresca M2 de 50 microlitros más BSA. Luego, para erosionar la zona pelúcida del embrión y reducir los obstáculos físicos adicionales para la administración de reactivos, transfiera los embriones a una gota precalentada de 100 microlitros de Tyrode, o solución AT, en una placa de 60 milímetros.
Observe continuamente los cigotos bajo un microscopio estereoscópico hasta que se erosione el 30% de la zona pelúcida, luego para diluir el AT, pase los embriones a través de cuatro gotitas de 50 microlitros de M2 más BSA. A continuación, determine un número apropiado de embriones que se han procesado contándolos bajo el microscopio estéreo. Diluir la BSA pasando los embriones a través de dos gotitas de 50 microlitros de medios séricos reducidos.
A continuación, pipetear en la boca de 25 a 30 embriones en una gota de 10 microlitros de medios séricos reducidos, luego use una pipeta de mano para agregar 10 microlitros de la ribonucleoproteína o complejo RNP. Diluir el glicerol viscoso del complejo RNP y homogeneizar la muestra pipeteando 10 veces o hasta que la mezcla ya no muestre viscosidad. A continuación, pipetear 20 microlitros de embrión y mezcla de RNP en una cubeta de electroporación de 0,1 centímetros evitando burbujas, luego para administrar los reactivos de edición en el cigoto, electropolar los embriones utilizando un protocolo de onda cuadrada de 30 voltios, 4 a 6 pulsos con una longitud de pulso de 3 milisegundos y 100 intervalos de pulso.
A continuación, agregue 50 microlitros de M2 más BSA en la parte superior de la cubeta para enjuagar los embriones de la cubeta y pipetear suavemente esta mezcla en un plato. Para el cultivo de embriones, transfiera de 20 a 30 cigotos a una gota de KSOM más BSA en una placa de cultivo preequilibrada y mueva los embriones a la gota. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% con 95% de humedad.
Al día siguiente, transfiera solo embriones de dos células a una gota fresca de mezcla de KSOM más BSA y devuelva la placa a la incubadora. Dejar o desechar los embriones muertos o no fecundados. Antes del genotipado, lave los embriones de blastocisto de mórula con dos gotas de DPBS para diluir los componentes del medio que podrían interferir con una reacción de PCR.
Usando una pipeta bucal, transfiera embriones individuales a un pocillo de una tira de PCR de 8 pocillos y agregue 10 microlitros de tampón de lisis. A continuación, para lisar los embriones, programe un termociclador a 55 grados centígrados durante 4 horas, luego inactive la proteinasa K con una incubación de 10 minutos a 95 grados centígrados. En este estudio, se muestra una estrategia de ejemplo para apuntar al locus de la tirosinasa del ratón como un control positivo, incluidos los diseños oligo y las estrategias de genotipado para la unión de extremos no homólogos y la reparación dirigida por homología.
Al administrar una sola guía, o sgRNA, la administración de RNP fue de hasta e incluyendo el 100% en las cepas de ratón C57 negro 6J y C57 negro 6N con formación de deleciones de inserción que ocurren al 50 a 100% y pequeños reemplazos basados en oligo que van del 17 al 63%. El protocolo está hecho, mejor. Además, minimice la exposición a la hialuronidasa y al ácido Tyrode. Este método describe la generación de un animal editado, la prueba de implantación o la viabilidad gestacional, o la realización del experimento varias veces para recopilar mediciones o imágenes y varias métricas durante el desarrollo previo a la plantación.
