Esta investigación fue financiada por premio de USDA-NIFA 2015-67015-23488 a Roger Cone. Los autores agradecen a Dr. Ronald Phelps para la descripción de los criterios de selección común cría en el video. Ahmed Elaswad y Karim Khalil gustaría agradecer egipcio Cultural y educativa oficina en Washington para la financiación de su investigación de doctorado.

Este experimento se llevó a cabo en la unidad de investigación de genética de peces, centro de investigación de pesquerías de E. W. Shell, Universidad de Auburn, Alabama. Todos los protocolos experimentales utilizados en este experimento fueron aprobados por la Universidad de Auburn institucional Animal Care y Comité uso (IACUC-AU) antes de inicia el experimento. Una lista de la maquinaria y equipo utilizado en este experimento puede encontrarse en la tabla de materiales. Los siguientes son los pasos y procedimientos para la preparación y microinyección de embriones de una célula de bagre de canal como se ilustra en la figura 1.
1. selección de acciones y desove de reproductores
<ol><li>Elegir sano bagre cría de la cepa o línea genética de interés. Hembras y machos de bagre de canal deben exhibir buenas características secundarias del sexo.</li>
	<li>Seleccionar los machos que tienen una amplia cabeza muscular que es más ancha que el resto de sus cuerpos con la papila genital bien desarrollada. Color oscuro, cicatrices y heridas de lucha territorial son también signos de preparación sexual. Seleccionar las hembras que tienen jefes que son más estrechos que el resto de sus cuerpos y tienen abdomen suave, palpable, bien redondeado. Para la precisión y evitar destacando los peces durante el manejo inicial, pare el alimentar a las hembras 2-3 días antes de examinar su preparación para el desove.</li>
	<li>Realizar manejo rápidamente pero con cuidado de peces. Para reducir el estrés de manejo, realizar todos los procedimientos que requieren manejo de hembras manteniendo peces en bolsas (32 m m tamaño de malla) de desove.</li>
	<li>Justo antes de la inyección de hormonas para inducir la ovulación, medir el peso corporal de las hembras.</li>
	<li>Colgar las bolsas de desove con las mujeres dentro de un flujo a través del tanque con el flujo de agua continuo y suficiente aireación.</li>
	<li>Asépticamente, carga al implantador que tiene una aguja 14 G con 85 μg/kg de implante de (LHRHa) análogo de la hormona de liberación de la hormona luteinizante. Enjuagar el sitio de inyección (musculatura dorsal) con solución salina estéril 0,9% antes de la inyección. Inserte al implantador en un ángulo de 45° y liberar el implante. Retirar la aguja y pasar el sitio de inyección con una bola de algodón previamente empapada en etanol al 70%.</li>
	<li>Lugar la bolsa de desove en el depósito para que el pescado esté totalmente sumergido en agua 15-20 cm por debajo de la superficie del agua. Adecuada aireación (sobre 5 ppm disuelto oxígeno) y buena calidad del agua son importantes para la ovulación de los huevos de alta calidad.</li>
	<li>Predecir el momento de la ovulación basado en la temperatura del agua mediante la relación de grados-hora (h)35. Tiempo de respuesta de grado h = tiempo entre la inyección de hormonas y la ovulación (h) * temperatura (° C) del agua. Por ejemplo, para un tiempo de respuesta de h grado de 900-1000, una mujer espera a desovar a las 36-40 h de tiempo de la inyección de la hormona a 25 ° C. Generalmente, el primer cheque de huevos se realiza en aproximadamente 36 h después de la inyección de hormona y luego en intervalos de 4 h.</li>
	<li>Para verificar la ovulación, levante suavemente la bolsa reproductora por encima de la superficie del agua mientras que usted está buscando los huevos que se fijan dentro de la bolsa de desove. Ver al menos 10 huevos indica que esta mujer está ovulando y lista para pelar de la mano.</li>
</ol>2. preparación del esperma
Nota: Espermatozoides se pueden preparar unos h antes de la ovulación esperada.
<ol><li>Eutanasia a los machos por un percusión golpe en la cabeza sin anestesia, ya que la anestesia tenga un efecto negativo sobre la motilidad del esperma.</li>
	<li>Recoger los testículos en un platillo pequeño, quitar cualquier tejido y lavar con 50 mL de solución salina 0.9% para eliminar sangre, si es necesario. Testículos bien desarrollados son de color blancos con muchas proyecciones viliformes ( figura 2).</li>
	<li>Determinar el peso de los testículos.</li>
	<li>Para preparar la solución de esperma para la fertilización del huevo, transferir los testículos al centro de una malla de 100 cm2 100 μm usando fórceps. Doblar la malla con los testículos dentro, aplastar los testículos y los espermatozoides del filtro en un tubo de recogida de 50 mL. Esto puede hacerse aplicando presión a los testículos dentro de la malla contra el borde del tubo de colección mediante el pulgar. Usar solución salina 0.9% lavar los espermatozoides de la malla en el tubo de la colección. Solución salina se puede Agregar hasta 10 mL/g de los testículos.</li>
	<li>Determinar la concentración de los espermatozoides, comprobar la motilidad y viabilidad. Nota: La concentración se puede determinar contando los espermatozoides en un volumen conocido de diluido de semen usando un hemocitómetro. Por otra parte, la densidad de esperma puede estimarse mediante la evaluación de la densidad óptica de semen usando un espectrofotómetro. En este método, la absorción en la longitud de onda de 505 nm es comparada con un gráfico de control que ha sido previamente preparado para la absorción de diferentes concentraciones de espermatozoides36. La motilidad del esperma se puede comprobar al microscopio como el tiempo de activación de los espermatozoides hasta el cese de esperma movimiento (llamado duración de motilidad)37. La viabilidad de los espermatozoides puede determinarse por la coloración de la esperma con tintes selectivos como el trypan azul, que se mancha espermatozoides no viables solamente, mientras que esperma viable seguirá siendo sin mancha. Sin embargo, para estos procedimientos de microinyección, esto no es necesario si los testículos están bien desarrollados.</li>
	<li>Almacenar esperma en solución salina al 0.9% de paso 2.5 a 4 ° C y usar dentro de 24 h después de la preparación.</li>
</ol>3. recolección y fertilización del huevo
<ol><li>Aplicar una capa muy fina de manteca a un diámetro de 20 cm limpio y seco desove pan vegetal.</li>
	<li>Lugar de la mujer en la solución anestésica que contiene 100 ppm de sulfonato de metano tricaine tamponada con bicarbonato de sodio (pH de la solución final debe ser 7.0) hasta que el pescado esté totalmente anestesiado38. PRECAUCIÓN: Metanosulfonato sulfonato de metano puede ser irritante si se inhala, ingiere o absorbe a través de la piel.</li>
	<li>Con cuidado, quitar los peces de la bolsa de desove y sumergirla en solución salina 0.9% lavar fuera de la solución anestésica. Seque el pescado completamente con una toalla limpia, evitando la remoción de la capa de moco en la superficie del cuerpo del pescado.</li>
	<li>Aplique grasa vegetal en el área alrededor de la rejilla de ventilación, incluyendo las aletas pélvicas, para evitar la fijación de los huevos durante el desmontaje de la mano.</li>
	<li>Mano tira de los huevos en el desove engrasado aplicando presión suave en los ovarios. Buenos huevos deben fluir libremente, color amarillo dorado y tiene mínimo o ningún grumos o coágulos de sangre (figura 2). Evite el contacto entre huevos y el agua antes de la fertilización, como el agua puede estimular el cierre del micrópilo.</li>
	<li>Para fertilizar los huevos para microinyección, transferencia de 200-300 huevos a un desove enmantecado. Etiquetas de plástico engrasado de la planta pueden utilizarse como una cuchara para transferir huevos en el desove enmantecado. Añadir 1-2 mL de la solución de esperma (del paso 2.5) a los huevos y mezclar suavemente. La proporción de los espermatozoides hacia el huevo debe ser aproximadamente 11.000 de la esperma/del huevo.</li>
	<li>Añadir agua a los huevos para activar el esperma y los huevos. Añada suficiente agua para cubrir un poco los huevos. Agitar suavemente los huevos para 30 s. fertilización debe ocurrir en 1 a 2 min. Es importante fertilizar los huevos que están dispuestos en una sola capa. Huevos de bagre se adhieren entre sí dificultando la microinject varias capas de embriones.</li>
	<li>Añadir más agua dulce a los huevos fecundados y los huevos a endurecer durante 10 – 15 minutos.</li>
	<li>Cubrir la bandeja de desove que contiene los huevos no fertilizados por una toalla mojada para evitar que se sequen y fertilizar durante unas horas. La fertilización puede hacerse de manera escalonada, por ejemplo, un lote de 200-300 huevos pueden ser fecundados cada 30 – 60 min para asegurar un suministro continuo de embriones en la etapa de una célula para microinyección y control no embriones. Evitar el contacto entre la toalla mojada y los huevos, los huevos pueden adherirse a la toalla mojada lo que hace difícil quitarlos. En este protocolo, óvulos fecundados dentro de 2-3 h después de decapar eficientemente fueron microinyectados y tenía éxito similar como huevos fertilizados inmediatamente después de la extracción.</li>
</ol>4. aguja de tracción y de carga
<ol><li>Tirar un vidrio de borosilicato de 1,0 mm OD capilar en 2 agujas (figura 3). Almacenar las agujas en una caja de papel con un trozo de esponja en el cual se hicieron varias incisiones. Para evitar romper la aguja, el diámetro de la esponja debe ser menor que la longitud del vástago de la aguja.</li>
	<li>Rompiendo un pedazo pequeño de la región más fina de la aguja utilizando un objeto punzante para abrir la punta de la aguja. Alternativamente, abra la aguja pellizcando fuera de la región más delgada de la punta con pinzas bajo el microscopio.</li>
	<li>Preparar la solución de la inyección mediante la mezcla de gRNA(s) con la proteína Cas9. Otros tipos de ARN o proteína también pueden ser inyectados con el mismo procedimiento. En este protocolo, gRNAs fueron diseñados para actuar dos del bagre el inmunes genes relacionados, toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene y preparados según Shah et al. con el uso de una alta fidelidad Taq polimerasa32,39. Los objetivos de la genómicos para gRNAs eran 5' GGA GGT GAA GCA GGA de CGA CGT 3' gen TICAM 1 (figura 4) y GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' 5' para el exón 1 del gen RBL con protospacer motivo adyacente (PAM) de la secuencia subrayada (figura 6).<ol>
<li>Objetivos guía RNA de ráfaga contra el genoma de bagre de canal en secuencia y seleccionar aquellos con no potenciales sitios de fuera de objetivo.</li>
		<li>Agregar rojo de fenol al color de la proteína de gRNA/Cas9 mezclar un tercio del volumen total.</li>
		<li>Ajustar la concentración final de proteína de gRNA/Cas9 mezcla con agua libre de nucleasa para que cada embrión se inyecta con 50 nL con gRNA ng aproximadamente 2,5 y 7,5 ng Cas9 proteína. Incubar la mezcla por 10 min en hielo antes de usarlo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Con un microloader, carga 5-10 μl de la mezcla de gRNA/Cas9 en la aguja de inyección insertando la microloader en el vástago de la aguja y expulsar la mezcla lentamente mientras retrae la punta de microloader (figura 3). Evite atrapar burbujas de aire dentro.</li>
	<li>Conecte la aguja en el soporte de Micropipetas y asegurar una conexión firme y luego fije el soporte a las amalgamas dentales. Garantizar la libre circulación estable. Aplique presión para microinyección abriendo el cilindro de nitrógeno y ajustar el regulador de presión. Nota: El volumen de inyección puede verse afectado por la presión, el diámetro de la abertura de la aguja y la duración de la inyección. Para determinar el volumen a inyectar, inyectar una gota de aceite mineral a un hemocitómetro. Si es necesario, puede ajustarse la presión, la duración de la inyección y el diámetro de la aguja para aumentar o disminuir el volumen de la inyección. Inyectar varias veces el aceite mineral para volumen constante.</li>
</ol>5. microinyección de embriones de bagre
<ol><li>Aplicar una capa muy fina de manteca a un plato de Petri limpia 100 mm vegetal.</li>
	<li>Usando una etiqueta de plástico engrasado de la planta, transferencia de 50-100 huevos de la sartén de la fertilización a la caja Petri y cúbralos con la solución de Holtfreter (tabla de materiales). Alinee los huevos uno contra otro en una sola capa. Esta alineación debe mantener los huevos en su lugar durante el proceso de microinyección.</li>
	<li>Coloque la placa de Petri con los huevos sobre la platina del microscopio y sosténgala con una mano. Baje la aguja con la otra mano (figura 3) hasta que perfora el corión y la yema en un único movimiento suave. La punta de la aguja debe ser lo más cerca posible al blastodisc antes de entregar el material de inyección.<ol>
<li>Presione el pedal para entregar el material de inyección en la yema de huevo. Si el blastodisc no es claramente visible, el material de inyección puede transmitirse en diferentes lugares de la yema. Para ello, se inserta la aguja hasta el final de la yema, y luego presionando el pedal y retirar la aguja se realizan simultáneamente para difundir el material de inyección a través de diferentes áreas de la yema. Hasta 50 nanolitros se puede inyectar en la yema de bagre de canal embriones, sin embargo, la cantidad de proteína de gRNA/Cas9 debe optimizarse para que cada gen lograr los mejores resultados para mutación tasa y embrión de supervivencia32.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retraer la aguja suavemente para no dañar el huevo. Mueva la caja Petri para inyectar otro huevo con el mismo procedimiento. Evitar el movimiento de la caja Petri durante el proceso de inyección ya que puede dañar el huevo o romper la aguja. Retirar los huevos que están roto o dañados debido a la microinyección. La inyección puede iniciarse a los 15-20 min después de la fertilización y continuar siempre y cuando los embriones están todavía en la etapa de una célula (hasta unos 60-90 min después de la fertilización).</li>
	<li>Coloque los embriones inyectados en solución de Holtfreter con 10 ppm de doxiciclina y continua aireación suave para 6 – 7 días hasta la eclosión de40. Cambiar la solución diariamente y eliminar embriones muertos.</li>
</ol>6. mutación detección
<ol><li>Al azar, recoger varios embriones inyectados en la fertilización post de 72 h, quitar la yema de huevo y extracto de ADN genómico. Son embriones de 3 – 5 no como control. Nota: El ADN genómico puede extraerse de embriones después del retiro de cáscaras de huevo y yema de huevo el material con digestión proteinasa K y etanol precipitación32.</li>
	<li>Amplifican un segmento de ADN que flanquean los objetivos genómicos para el gRNA de cada gen, donde se espera que las mutaciones ocurren con una alta fidelidad de la polimerasa de Taq32. Para TICAM 1, los cebadores 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (adelante) y 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (atrás) fueron utilizados para amplificar un 750 bp mientras que para RBL, los cebadores 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (adelante) y 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (atrás) se utiliza para amplificar un segmento 375 de bp del gen RBL.<ol>
<li>Utilice la siguiente reacción de PCR: hasta 20 μl de agua de grado de polimerización en cadena; 1 x alta fidelidad tampón de reacción de enzima Taq con MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 0,4 μm de cada uno de la cartilla de adelante y atrás del mismo grupo, 100-300 ng de ADN genómico y 1,25 unidades de mezcla de enzimas Taq de alta fidelidad. Realizar ciclismo condiciones PCR: desnaturalización inicial a 94 ° C por 3 min; 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C por 30 s, recocido a 60 ° C por 55 s para TICAM y 40 s de RBL, extensión a 72 ° C por 1 min/kb; y extensión final a 72 ° C durante 10 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detectar los embriones mutantes utilizando un método de detección de mutación como secuenciación de productos PCR purificados, ensayo de detección de mutación de topógrafo, análisis de movilidad del heterodúplex, pérdida del sitio de reconocimiento de enzimas de restricción, o cualquier otro método de detección de mutación que es apropiado para el objetivo. En este protocolo, detectar embriones mutantes mediante el ensayo de detección de mutación de topógrafo para TICAM 1 y pérdida de enzima de restricción que SAPI cortar sitio así como la secuenciación de productos PCR purificados para el gen RBL.</li>
	<li>Para identificar alelos del mutante, clonar los productos PCR y secuencia vectores de colonias individuales. Los alelos del mutante presentados en la figura 4 y figura 6 vinieron de embriones inyectados. Productos PCR de seis microinyectados y embriones control 3 para cada gen se agruparon en dos tubos separados, uno de los embriones microinyectados y el otro para embriones control, rápidamente clonados y 86 vectores TICAM 1 y 48 vectores de gen RBL secuenciados, incluyendo 8 secuencia de reacciones de 3 embriones no de control para cada gen.</li>
	<li>Para identificar diferentes alelos del mutante, comparar las secuencias de los embriones mutantes para la secuencia de tipo salvaje usando cualquier herramienta de alineación de secuencia de DNA como ráfaga o T-café.</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.

Se presentó un protocolo detallado para microinyección de embriones de bagre de canal para lograr el golpe de gracia del gene. Inyección de proteína CRISPR/Cas9 en la yema de huevo es mucho más sencilla, ahorra tiempo y no requiere formación amplia en comparación con microinjecting el blastodisc del embrión de una célula, que es la técnica común para la mayoría de la transferencia de genes y gene edición con pescado 30 , 42. el protocolo actual demos...

Microinyección es una técnica de laboratorio común utilizada para entregar una pequeña cantidad de una sustancia tales como DNA, RNA, proteínas y otras macromoléculas en células o embriones a través de un capilar de vidrio1. Microinyección se realiza mediante la instalación de equipos especiales incluyendo un microinyector, instrumental quirúrgico y un microscopio2. La técnica se ha utilizado por los investigadores para modificar genéticamente muchos organismos a través de la generación de transgénicos, knockouts de genes y terapia genética, con el objetivo de comprender la dinámica de componentes intracelulares3,4 , 5.
El bagre de canal (Ictalurus punctatus) es la especie más popular del bagre en la acuicultura y las actividades de pesca recreativa en los Estados Unidos. Hay una creciente necesidad de estudio de genómica funcional en bagre de canal, y la secuencia del genoma completo de bagre de canal aumenta la utilidad de los recientes avances en genoma edición herramientas6,7. Comprender la función del gen no sólo enriquecería la investigación que se lleva a cabo en el bagre, pero también podría conducir a programas de mejoramiento genético más efectivos para mejorar la industria del bagre. Una vez que se identifican genes críticos para un determinado rasgo de interés, pueden ser utilizados para mejorar genéticamente la producción de bagre a través de la edición del genoma para generar alelos beneficiosos, selección de estos alelos, suprimiendo los alelos perjudiciales, transferencia de los alelos beneficiosos a través de la transgénesis, o alguna combinación de estas opciones. Combinar los mejores genes para diferentes características comercialmente beneficiosos de diferentes especies de una peces mejoraría grandemente la productividad y rentabilidad de las operaciones de producción de pescado8.
Knockout de genes es un método directo para el estudio de las funciones del gene in vivo. Mutaciones a nivel de ADN serán heredadas por las generaciones futuras que facilitarán el estudio de sus efectos en diferentes generaciones. Herramientas de edición diferentes del genoma han sido desarrollados incluyendo zinc finger nucleasas (ZFNs), transcripción nucleasas activador como efectoras (TALENs) y agrupadas regularmente otro corto palindrómico repeticiones/CRISPR-proteína asociada 9 (CRISPR/Cas9 ) sistema9,10,11,12.
El sistema CRISPR/Cas9 es una herramienta potente y eficaz que se ha utilizado para editar secuencias genómicas de ADN incluyendo knockout de genes de peces a través de RNA-dirigida específica escote de DNA5,13. El sistema consta de un RNA de la guía (gRNA), que determina la secuencia específica en el genoma y una enzima endonucleasa de ADN, Cas9. El sistema CRISPR/Cas9 puede diseñarse para cualquier secuencia en el genoma con varias ventajas sobre ZFNs y TALENs de destino: (1) menor costo de ingeniería (2) más fácil Unión (3) más específica de RNA guía de la secuencia Diana y reducido objetivo mutaciones (4) secuencias múltiples pueden ser dirigidas con gRNA diferentes en la misma proporción de tiempo (5) alta mutagénesis en los genes que podrían no ser transformado por TALENs y (6) tasa de transmisión mejorada del germline de mutaciones para hasta doblez 6 comparado con ZFNs y TALENs14, 15,16,17,18.
El principal método alternativo para la microinyección es electroporación, en el cual se aplican impulsos eléctricos a embriones o células para aumentar la permeabilidad de la membrana y la absorción de moléculas biológicas19,20. Varios peces transgénicos se generaron usando electroporación como medaka (Oryzias latipes), pez cebra (Danio rerio), salmón chinook (Oncorhynchus tshawytscha), bagre, dorada (Sparus sarba), y común carpa (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.
La electroporación se ha utilizado para ofrecer proteína de DNA, RNA y Cas9 de plásmido por golpe de gracia del gene. En células de mamífero, Cas9/gRNA plásmido ADN Cas9 mRNA/gRNA y complejos de la proteína/gRNA Cas9 fueron entregados mediante electroporación y las tarifas de mutagénesis fueron mayores con complejos de proteínas/gRNA Cas9 para más electroporación condiciones probadas27. En el cordado de la coloración (Savignyi intestinalis), TALENs expresar construcciones fueron electroporated en los huevos fertilizados para inducir knockout de genes múltiples28. ZFNs expresando plásmido construcciones fueron electroporated para noquear a la hormona luteinizante en el bagre de canal29. Sin embargo, una vez introducidos en la célula, plásmido construcciones deberá ser transcrito a RNA y traducido a proteínas funcionales antes de que puede apuntar la secuencia de ADN deseada, que probablemente retrasaría el momento de la mutagénesis en comparación con microinyección del ARN / proteína. Como el desarrollo de un embrión, mutagénesis tardía aumenta el mosaicism de fundadores inyectados. Además, la expresión transgénica es poco probable alcanzar el nivel de expresión posible con microinyección, bajando la eficiencia de mutagénesis.
Como un medio para introducir herramientas de edición del genoma en las células, microinyección tiene varias ventajas sobre electroporación. Moléculas de edición genómica puede introducirse confiablemente en células o embriones mediante microinyección30. Se necesita menos material de inyección. Es fácil determinar las cantidades de material inyectado. Mayor mutación tarifas con mosaicism bajo en los peces del fundador pueden ser alcanzado que mejoraría del germline transmisión de mutaciones a F1. Menos peces fundador deben ser analizados para producir la primera generación, debido a la mayor tasa de mutación. En electroporación, peces fundador deben analizarse que aumentarán los costos. Sin embargo, la supervivencia de los embriones microinyectados de bagre de canal es menor que electroporated que, aunque esto se puede solucionar mediante la inyección de más embriones31,32. En bagre de canal, la supervivencia de los embriones microinyectados yema osciló entre 16 y 55%, dependiendo de los genes blanco y la dosis de proteína de gRNA/Cas932.
Regular microinyección de embriones de bagre es técnicamente exigente y mucho tiempo, sin embargo, un rápido y eficaz protocolo de microinyección CRISPR/Cas9 proteína se presenta para embriones de bagre de canal. Este protocolo requiere menos tiempo y experiencia ya que la solución de proteína CRISPR/Cas9 se inyecta en la yema de uno de embriones de células. Cientos de huevos fecundados se pueden inyectar en 1 h (aproximadamente el tiempo necesario para que la primera división celular que se produzca). Para validar el protocolo, dos genes relacionados con la susceptibilidad de la enfermedad fueron eliminados en bagre de canal, toll/interleukin 1 gene del receptor del dominio-que contienen adaptador molécula (TICAM1) y el gene de lectinas (RBL) obligatorio de ramnosa. TICAM 1 participa en la vía de señalización iniciada por el receptor de tipo toll (TLR) 3. En bagre de canal, TICAM 1 fue significativamente upregulated después del desafío bacteriano con Edwardsiella ictaluri, mientras que fue regulada en bagre azul, una especie resistente E. ictaluri33. RBL desempeña un papel importante en la infección temprana con Flavobacterium columnare, el agente causativo de la enfermedad columnaris, donde aguda y robusta upregulation se registró en una cepa susceptible columnaris bagre de canal en comparación con un cepa resistente columnaris34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:136px;">Reproboost implant</td>
			<td style="width:115px;">Center of Marine Biotechnology</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">TRICAINE-S</td>
			<td style="width:115px;">Western Chemical. Inc.</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:136px;">Phenol red</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">P0290</td>
			<td style="width:171px;">0.5%, sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;">213709</td>
			<td style="width:171px;">For visualizing the eggs during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Microinjector</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MPPI-3</td>
			<td style="width:171px;">For the delivery of the injection material into the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MM33&#160;</td>
			<td style="width:171px;">For holding and controlling the movement of the injection needle.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Eppendorf Microloader</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">5242956.003</td>
			<td style="width:171px;">For loading injection solution into microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:136px;">Vertical needle puller</td>
			<td style="width:115px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:99px;">Model 720</td>
			<td style="width:171px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Cas9 protein</td>
			<td style="width:115px;">PNA Bio Inc.&#160;</td>
			<td style="width:99px;">CP01</td>
			<td style="width:171px;">Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Expand High FidelityPLUS PCR System</td>
			<td style="width:115px;">&#160;Roche Diagnostics, USA</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">25384-302</td>
			<td style="width:171px;">For holding the embryos during the microinjection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Crisco</td>
			<td style="width:115px;">The J.M. Smucker Company</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:136px;">Holtfreter`s solution</td>
			<td style="width:115px;">Home Made</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Doxycycline hyclate USP (monohydrate)</td>
			<td style="width:115px;">Letco Medical</td>
			<td style="width:99px;">690904</td>
			<td style="width:171px;">Antibiotic added to Holtfreter&#39;s solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of crispr/cas9 protein into channel catfish, ictalurus punctatus, embryos for gene editing

Se ha secuenciado el genoma completo del bagre de canal, Ictalurus punctatus, conduciendo a mayores oportunidades para estudiar la función genética de bagre de canal. Golpe de gracia del gene se ha utilizado para el estudio de estos genes funciones en vivo. El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) el sistema es una potente herramienta para editar secuencias genómicas de ADN para alterar la función génica. Mientras que el enfoque tradicional ha sido introducir CRISPR/Cas9 mRNA en los embriones de la célula a través de microinyección, esto puede ser un proceso lento e ineficiente en el bagre. Aquí, se describe un protocolo detallado para microinyección de embriones de bagre de canal con CRISPR/Cas9 proteína. Brevemente, óvulos y espermatozoides fueron recogida y luego artificial fertilización realizada. Los huevos fertilizados se transfirieron a una placa de Petri que contenga solución de Holtfreter. Volumen de inyección fue calibrado y luego guía RNAs/Cas9 dirigido a los toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM 1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene fueron microinyectados en la yema de los embriones de una célula. El golpe de gracia del gene era acertado como indels fueron confirmados por secuenciación del ADN. Las alteraciones de la secuencia de la proteína prevista debido a estas mutaciones incluyen mutágeno ' frameshift ' y truncarán de la proteína debido a codones de parada prematura.

Para demostrar la eficacia del Protocolo de microinyección, fueron microinyectados gRNAs diseñados para atacar el bagre de canal toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene.
TICAM 1 Secuencia de la DNA de vectores de las colonias individuales de productos PCR combinados, clonados revelaron las mutaciones indel inducida...

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Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Se presenta un protocolo de microinyección simple y eficiente para la edición de genes en embriones de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9. En este protocolo, guía RNAs y proteínas Cas9 fueron microinyectados en la yema de una célula de embriones. Este protocolo ha sido validada por la anulación de dos genes relacionados con la inmune de bagre de canal.

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

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QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

QTL Mapping y CRISPR / Cas9 Edición para identificar un gen de resistencia a fármacos en<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Investigación

Genética

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 Gene edición para hacer condicionales mutantes de humano parásito de la Malaria por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Edición génica precisa mediada por Ribonucleoproteína por electroporación de tubo

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Introducción de un Knockout Gene Directamente en la etapa de Amastigote de Trypanosoma cruzi usando el sistema CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

Edición del genoma mediado por CRISPR-Cas9 en el Ascomicete Filamentoso Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...