La técnica de claridad descrita por primera vez en 2013 es una técnica de limpieza de tejidos que permite el muestreo de grandes cantidades de células, vasos sanguíneos, por lo que incluso proteínas como una resolución de una sola célula en rodajas gruesas de cerebro. Esta técnica permite el estudio de estructuras microscópicas intactas haciendo que todo el cerebro sea transparente. Este protocolo es un chip simple y una tubería directa para la limpieza de tejidos.
Esta técnica se puede utilizar para limpiar tejidos en otros sistemas además de los tejidos cerebrales. Para comenzar, selle el tubo y la tapa con parafilm y perfore dos orificios en la tapa. Luego transfiera el gas nitrógeno del tanque utilizando una tubería flexible con cinco milímetros de diámetro interno y una aguja de calibre 19 conectada en su extremo.
Comience a desgasificar conectando la tubería al tubo y permitiendo el intercambio de gases durante 30 minutos a temperatura ambiente. Separe la tubería e inmediatamente selle los orificios con arcilla de modelado. Luego transfiera los tubos sellados de desgasificación a un baño de 37 grados Celsius durante 3 1/2 horas para polimerizar la solución de hidrogel.
Saque el cerebro del tubo. Usando toallitas de laboratorio, retire el hidrogel polimerizado alrededor del cerebro asegurándose de que no quede gel residual adherido a la superficie del cerebro. Divida el cerebro en rebanadas gruesas que contengan todas las áreas de interés.
Coloque las rodajas en la primera solución de limpieza e incube a 37 grados centígrados con rotación a 70 RPM durante 24 horas. Mientras tanto, prepare un tubo perforado para colocar el cerebro. Coloque el tubo perforado en un vaso de precipitados lleno de una segunda solución de limpieza en un dispositivo de agitación.
Luego coloque el cerebro en el vaso de precipitados y séllelo con papel de aluminio para evitar el blanqueamiento. Después de que el tejido se vuelva transparente, transfiera el cerebro a PBST en incubación a 37 grados Celsius con rotación a 70 RPM durante 24 horas. Reemplace la solución con PBST fresco y continúe la incubación durante otras 24 horas.
Luego transfiera el cerebro a PBS a temperatura ambiente durante 24 horas. Después de 24 horas, retire el cerebro de PBS y transfiéralo a la solución de coincidencia de índice de refracción. Incubar el cerebro a 37 grados centígrados durante la noche.
Primero, coloque la muestra en el centro de la diapositiva. Usando pegamento caliente, cree paredes en los bordes del portaobjetos, casi tan altas como el tejido. Asegúrese de dejar un pequeño espacio en una de las esquinas.
A medida que la capa de pegamento caliente se acerca a la altura de la rebanada cerebral, aplique una o dos gotas de la solución de coincidencia de índice de refracción en la muestra para humedecer la superficie superior y evitar la formación de burbujas. Mientras el pegamento caliente todavía es líquido, selle la parte superior con un deslizamiento de cubierta, colocándolo de la manera más uniforme posible y luego llene la cámara con la solución de coincidencia de índice de refracción. Cierre el espacio con pegamento caliente.
Si las paredes de pegamento caliente se extienden más allá de los bordes de la diapositiva, corte los bordes que se extienden. Si se utiliza un objetivo de inmersión en aceite para la obtención de imágenes, agregue otros dos o tres milímetros de pegamento a las paredes sobre el deslizamiento de la cubierta para retener la solución de inmersión. Después de este protocolo, el tejido cerebral será eliminado.
Se prepararon cortes cerebrales claros utilizando este protocolo para visualizar poblaciones de astrocitos y neuronas en la región CA1 del hipocampo de ratón. Todos los astrocitos expresaron tdTomato y las neuronas excitadoras expresaron H2B-GFP en sus núcleos. La cámara preparada para el tejido clarificado fue óptima para la obtención de imágenes bajo un microscopio de dos fotones o confocal.
Usando un microscopio de dos fotones, se observaron más de 300 astrocitos en una sección despejada de la región CA1 del hipocampo del ratón. Los astrocitos del hipocampo en células rojas y piramidales, somata en verde eran visibles y el tejido grueso y transparente representaba la proximidad espacial entre estos dos tipos de células. Usando un microscopio confocal láser de barrido, se rastrearon haces axonales de neuronas excitatorias a través de todo un hemisferio.
Se trazaron haces verdes desde el hipocampo dorsal hacia los cuerpos súper mamiles. Los haces rojos fueron trazados desde los cuerpos milares hacia su origen en el hipocampo de ventilación. Factores como la temperatura, las concentraciones y el tiempo de incubación influyeron en el resultado del procedimiento de claridad.
Por lo tanto, la precisión en cada paso del protocolo es vital para el éxito de lograr un tejido claro. Usando esta técnica, medimos las distancias entre las neuronas y los astrocitos en varias estructuras cerebrales. Este protocolo permitió el análisis de dos a tres órdenes de magnitud más células que en estudios anteriores.
