La nostra ricerca si concentra sulla comprensione del ruolo del sistema nervoso nella progressione dell'aterosclerosi. In particolare, per ogni interazione con la cresta, miriamo a rispondere a come il nervo cambia durante l'aterosclerosi e come la sua interazione influenza la progressione della malattia. Diverse tecnologie all'avanguardia sono attualmente utilizzate per far progredire la ricerca sull'aterosclerosi e migliorare la comprensione dei meccanismi della malattia.
Questi includono la pulizia dei tessuti e l'imaging 3D, le tecniche microscopiche avanzate, l'intelligenza artificiale, il sequenziamento di singole cellule e l'apprendimento automatico. Durante la progressione dell'aterosclerosi, i componenti della parete arteriosa subiscono una robusta ristrutturazione. Delineare i cambiamenti in 3D e l'imaging ad alta risoluzione dei tessuti intatti sono le principali sfide sperimentali.
Gli strumenti di imaging qui descritti aiuteranno i ricercatori e i cardiologi a comprendere meglio la malattia e, infine, a curare i pazienti. Il protocollo qui descritto offre diversi vantaggi rispetto alle tecniche tradizionali come l'imaging dei tessuti profondi dei tessuti intatti, nonché la visualizzazione della loro struttura altrimenti inaccessibile. Questi protocolli aiuteranno a comprendere meglio l'interazione cellula-cellula e cellula-tessuto per migliorare la comprensione della progressione della malattia.
La visualizzazione dei cambiamenti cellulari e strutturali in 3D nel tessuto intatto può fornire nuove informazioni per comprendere meglio le domande biologiche senza risposta nella ricerca cardiovascolare. Per iniziare, posiziona il topo anestetizzato su una piastra di schiuma ricoperta di carta assorbente chirurgica. Fissa le braccia e le gambe del mouse in posizione supina usando dei nastri adesivi.
Disinfettare il torace con etanolo al 75%. Raccogliere il sangue dal ventricolo sinistro utilizzando una siringa monouso da un millilitro. Quindi praticare un'incisione sulla linea mediana sul torace e una piccola incisione nell'atrio destro.
Perfondere il ventricolo sinistro del topo con 10 millilitri di EDTA da cinque millimolari in PBS per cinque minuti fino a quando il sangue non viene espulso, seguiti da 20 millilitri di PBS per 5-10 minuti. Infine, perfondere con 10 millilitri di paraformaldeide al 4% per 20 minuti. Sotto uno stereomicroscopio da dissezione, rimuovere gli organi interni, compresi gli organi gastrointestinali e riproduttivi.
Lascia intatti il cuore, l'aorta e i reni. Quindi rimuovere con cura il timo e il tessuto adiposo circostante. Esporre l'intera aorta dall'aorta ascendente alla biforcazione iliaca.
Raccogli l'intera aorta e mettila in una capsula di Petri piena di PBS. Separare l'aorta in segmenti diversi e dividerla longitudinalmente per due 2, 2'Tiodietanolo o TDE clearing. Appuntare l'aorta della faccia terminale su una lastra di cera nera piatta a forma di Y e fissarla in paraformaldeide al 4% durante la notte a quattro gradi Celsius.
Il giorno successivo, sganciare l'aorta e trasferirla nel PBS per un lavaggio di cinque minuti. Quindi trasferire l'aorta in una soluzione bloccante per due ore per il blocco e la permeabilizzazione. Successivamente, incubare l'aorta con gli anticorpi primari nella soluzione bloccante per 24 ore.
Lavare l'aorta in PBS per cinque minuti, ripetendo cinque volte prima di incubare con anticorpi secondari in siero d'asino normale al 10% e DAPI per la colorazione nucleare durante la notte, trasferire l'aorta colorata in una concentrazione crescente di soluzione di TDE. Quindi, incollare bene il distanziatore di imaging rettangolare appiccicoso su entrambi i lati su un vetrino pulito e trasferire l'aorta liberata, assicurandosi che l'avventizia aortica sia rivolta verso il vetrino coprioggetti. Montare l'aorta con gocce di soluzione di TDE al 60% e fissare con cura un vetrino coprioggetti al pozzo evitando bolle d'aria.
Accendi il microscopio a scansione laser confocale invertito dotato di un obiettivo a immersione in olio 20x. Sintonizzare i rilevatori a diodi ibridi in base ai coloranti per macchie. Regolare le impostazioni di visualizzazione e selezionare il formato XY 1024x1024 pixel per l'imaging.
Far cadere l'olio da immersione sul vetrino coprioggetti e spostare grossolanamente l'obiettivo 63x verso il campione fino a toccare l'olio da immersione e il vetrino coprioggetti. Quindi identificare la regione di interesse e acquisire Z-stack dal lato avventizio dell'aorta terminale a passi da due a quattro micrometri fino a 60 micrometri di profondità per l'imaging tridimensionale. Assegna un nome al file con i dettagli del campione e i dettagli della scansione e salva i dati.
Utilizzando un microscopio multifotone verticale dotato di un obiettivo 20x, è possibile acquisire pile Z dal lato abluminale con un passo da 10 a 15 micrometri fino a 700 micrometri di profondità. Dopo aver anestetizzato e perfuso il topo con PBS e paraformaldeide, sezionare la parte del corpo sopra il livello del diaframma. Fissare la parte inferiore del corpo con il 4% di paraformaldeide per uno o due giorni a quattro gradi Celsius.
Quindi, lavare accuratamente il campione in PBS per 10 minuti, ripetendo tre volte. Incubare il campione in una soluzione cubica al 20% per 48 ore. Dopo il lavaggio con PBS, incubare il campione in soluzione PGST per una notte per la permeabilizzazione e il blocco.
Il giorno successivo, incubare il campione con anticorpi primari in soluzione PGST a quattro gradi Celsius agitando delicatamente per 10-12 giorni. Dopo aver lavato il campione in PGST, aggiungere anticorpi secondari in DAPI in PGST a quattro gradi Celsius per sette giorni. Lavare accuratamente il campione in PGST per un'ora, ripetendo cinque volte.
Trasferire il campione colorato in una serie di concentrazioni aumentate di soluzioni di lavoro tetraidrofurane per la disidratazione, incubando 12 ore per concentrazione. Dopo la disidratazione, porre il campione in una soluzione assoluta di diclorometano per tre ore per la rimozione dei lipidi. Quindi, incubare il campione in una soluzione di alcol benzilico benzilbenzoato corrispondente all'indice di rifrazione per tre-sei ore.
Per iniziare, caricare le immagini con tasselli Z-stack dell'aorta del topo e delle immagini della parte inferiore del corpo sulla workstation di elaborazione delle immagini. Per codificare a colori la profondità del volume di una cella o di una struttura, utilizzare un software di ripristino delle immagini per deconvoluzione dell'immagine grezza. Nel software Fiji, generare una proiezione di massima intensità dei dati deconvoluti utilizzando la codifica temporale a colori.
Caricare la serie di immagini TIFF con tasselli Z-stack nel software. Utilizzando il plug-in di stitching delle Fiji, cuci le immagini e salvale in formato TIFF. Quindi, carica le immagini unite nel software di visualizzazione tridimensionale per la segmentazione delle immagini.
Tracciare manualmente le strutture neuronali sull'asse X-Y-Z lungo l'intero percorso tra l'aorta e i gangli. Carica immagini pre-elaborate nel software di analisi delle immagini. Utilizzare l'autofluorescenza per segmentare l'aorta e i tessuti connettivi.
Applicare pseudocolori separati per visualizzare la parete aortica e la placca distinte. Infine, utilizza la funzione di equalizzazione dell'istogramma adattivo a contrasto limitato per migliorare il contrasto locale sullo sfondo delle immagini elaborate. L'aorta aterosclerotica eliminata dal TDE ha rivelato cellule T colorate con CD3e nelle placche, un'estesa neogenesi delle fibre nervose colorate con NF200 negli organi linfoidi terziari arteriosi.
L'imaging multi-fotone dell'aorta addominale malata in topi knockout per APOE ha mostrato la germinazione dell'assone che esprime NF200 in regioni prive di cellule B B220 positive all'interno degli organi linfoidi terziari dell'arteria. L'imaging a foglio luminoso dell'addome di topo ripulito con iDISCO ha visualizzato la relazione spaziale tra l'aorta e i gangli simpatici con assoni colorati con NF200 di nuova formazione sull'avventizia adiacente alla placca aterosclerotica.
