私たちの研究は、アテローム性動脈硬化症の進行における神経系の役割を理解することに焦点を当てています。具体的には、隆起とのそれぞれの相互作用について、アテローム性動脈硬化症の間に神経がどのように変化するか、そしてその相互作用が疾患の進行にどのように影響するかを明らかにすることを目指しています。現在、アテローム性動脈硬化症の研究を進め、疾患のメカニズムの理解を深めるために、いくつかの最先端技術が使用されています。
これには、組織の透明化と3Dイメージング、高度な顕微鏡技術、人工知能、シングルセルシーケンシング、機械学習が含まれます。アテローム性動脈硬化症の進行中、動脈壁コンポーネントはしっかりと再構築されます。無傷の組織の3Dおよび高解像度イメージングで変化を描写することは、実験上の重要な課題です。
ここで説明するイメージングツールは、研究者や心臓専門医が病気をよりよく理解し、最終的には患者の治療に役立つのに役立ちます。ここで説明するプロトコルは、無傷の組織の深部組織イメージングや、他の方法ではアクセスできないそれらの構造の可視化など、従来の技術に比べていくつかの利点を提供します。これらのプロトコルは、細胞間および細胞-組織の相互作用をよりよく理解し、疾患の進行の理解を深めるのに役立ちます。
無傷の組織の細胞および構造変化を3Dで視覚化することで、心血管研究における未解決の生物学的問題をよりよく理解するための新たな洞察を得ることができます。まず、麻酔をかけたマウスを、外科用ペーパータオルで覆われた発泡スチロールプレートの上に置きます。マウスの腕と脚を粘着テープを使用して仰臥位に固定します。
胸部を75%エタノールで消毒します。1ミリリットルの使い捨て注射器を使用して左心室から血液を採取します。次に、胸部に正中線を切開し、右心房に小さな切開を行います。
マウスの左心室にPBSで10ミリリットルの5ミリモルEDTAを5分間注入し、血液が洗い流されるまで5分間、続いて20ミリリットルのPBSを5〜10分間灌流します。最後に、10ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで20分間灌流します。解剖実体顕微鏡で、胃腸器官や生殖器官などの内臓を切除します。
心臓、大動脈、腎臓はそのままにしておきます。次に、胸腺と周囲の脂肪組織を慎重に取り除きます。上行大動脈から腸骨分岐部までの大動脈全体を露出させます。
大動脈全体を収穫し、PBSを充填したペトリ皿に入れます。大動脈を異なるセグメントに分離し、縦方向に分割して、2つの2、2'チオジエタノール、またはTDEクリアリングを行います。端面の大動脈をY字型の平らな黒いワックスプレートに固定し、4%パラホルムアルデヒドで摂氏4度で一晩固定します。
翌日、大動脈のピンを外し、PBSに移して5分間洗浄します。次に、大動脈をブロッキング溶液に2時間移し、ブロッキングと透過化を行います。次に、大動脈を一次抗体とブロッキング溶液中で24時間インキュベートします。
PBSで大動脈を5分間洗浄し、5回繰り返してから、10%正常ロバ血清およびDAPI中の二次抗体とインキュベートして一晩核染色し、染色した大動脈をTDE溶液の濃度を上げます。次に、両面粘着性のある長方形のイメージングスペーサーをきれいなスライドガラスにしっかりと貼り付け、クリアされた大動脈を移し、端面の大動脈外膜がカバースリップに面していることを確認します。大動脈に60%TDE溶液を滴下して取り付け、気泡を避けてカバースリップをウェルに慎重に取り付けます。
20倍油浸対物レンズを装備した倒立共焦点レーザー走査型顕微鏡の電源を入れます。ハイブリッドダイオード検出器は、染色染料に基づいて調整します。表示設定を調整し、イメージング用に1024x1024ピクセルのXY形式を選択します。
浸漬油をカバースリップに滴下し、63倍対物レンズをサンプルに向かって粗く動かし、液浸油とカバースリップに触れます。次に、関心領域を特定し、端面大動脈の外膜側から、3次元イメージングのために2〜4マイクロメートルのステップサイズから最大60マイクロメートルの深さでZスタックを取得します。ファイルにサンプルの詳細とスキャンの詳細を付け、データを保存します。
20倍対物レンズを装備した直立多光子顕微鏡を用いて、10〜15マイクロメートルのステップサイズから700マイクロメートルの深さまで、アブルミナル側からZスタックを取得します。マウスに麻酔をかけ、PBSとパラホルムアルデヒドで灌流した後、横隔膜レベルより上の体部分を解剖します。下半身を4%パラホルムアルデヒドで4°Cで1〜2日間固定します。
次に、サンプルをPBSで10分間、3回繰り返して十分に洗浄します。サンプルを20%立方体溶液で48時間インキュベートします。PBSで洗浄した後、サンプルをPGST溶液で一晩インキュベートし、透過化とブロッキングを行います。
翌日、サンプルを一次抗体とPGST溶液中で摂氏4度でインキュベートし、10〜12日間穏やかに振とうします。PGSTでサンプルを洗浄した後、PGSTのDAPIで二次抗体を摂氏4度で7日間添加します。PGSTでサンプルを1時間、5回繰り返して十分に洗浄します。
染色したサンプルを、脱水のために一連の高濃度のテトラヒドロフランワーキング溶液に移し、濃度ごとに12時間インキュベートします。脱水後、サンプルを絶対ジクロロメタン溶液に3時間入れて脂質を除去します。次に、ベンジルアルコールベンジル安息香酸溶液に一致する屈折率でサンプルをインキュベートします。
まず、マウス大動脈と下半身の画像のZスタックタイル画像を画像処理ワークステーションにロードします。セルまたは構造のボリューム深度を色分けするには、画像復元ソフトウェアを使用して生の画像をデコンボリューションします。Fiji ソフトウェアで、時間カラー コーディングを使用して、デコンボリューションされたデータの最大強度投影を生成します。
Zスタックタイル化されたTIFF画像シリーズをソフトウェアにロードします。フィジーステッチングプラグインを使用して、画像をステッチし、TIFF形式で保存します。次に、ステッチした画像を3次元視覚化ソフトウェアにロードして、画像セグメンテーションを行います。
X-Y-Z軸のニューロン構造を、大動脈と神経節の間の経路全体に沿って手動でトレースします。前処理された画像を画像解析ソフトウェアにロードします。自家蛍光を使用して、大動脈と結合組織をセグメント化します。
別々の疑似色を適用して、明確な大動脈壁とプラークを視覚化します。最後に、コントラスト制限された適応ヒストグラム均等化機能を使用して、処理された画像の背景上のローカルコントラストを強化します。TDEをクリアしたアテローム性動脈硬化性大動脈は、プラーク中のCD3e染色T細胞、動脈三次リンパ器官におけるNF200染色神経線維の広範な新生を明らかにしました。
APOEノックアウトマウスの罹患腹部大動脈の多光子イメージングでは、動脈三次リンパ器官内のB220陽性B細胞を欠く領域にNF200を発現する軸索の発芽が示されました。iDISCOクリアマウス腹部のライトシートイメージングにより、アテローム性動脈硬化プラークに隣接する外膜上に新たに形成されたNF200染色軸索を有する大動脈と交感神経節との空間的関係を可視化した。
