본 연구는 죽상동맥경화증 진행에서 신경계의 역할을 이해하는 데 중점을 두고 있습니다. 특히 능선과의 각 상호 작용에 대해 우리는 죽상동맥경화증 동안 신경이 어떻게 변화하는지, 그리고 그 상호 작용이 질병 진행에 어떤 영향을 미치는지에 대한 답을 찾는 것을 목표로 합니다. 현재 질병 메커니즘에 대한 이해를 높이기 위해 죽상동맥경화증 연구를 발전시키기 위해 여러 첨단 기술이 사용되고 있습니다.
여기에는 조직 투명화 및 3D 이미징, 고급 현미경 기술, 인공 지능, 단일 세포 염기서열 분석 및 기계 학습이 포함됩니다. 죽상동맥경화증이 진행되는 동안, 동맥벽 구성요소는 강력한 재구조를 겪습니다. 온전한 조직의 3D 및 고해상도 이미징의 변화를 묘사하는 것이 주요 실험 과제입니다.
여기에 설명된 이미징 도구는 연구원과 심장 전문의가 질병을 더 잘 이해하고 궁극적으로 환자를 치료하는 데 도움이 될 것입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 온전한 조직의 심층 조직 이미징뿐만 아니라 다른 방법으로는 접근할 수 없는 구조의 시각화와 같은 기존 기술에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 세포-세포 및 세포-조직 상호 작용을 더 잘 이해하여 질병 진행에 대한 이해를 높이는 데 도움이 될 것입니다.
온전한 조직에서 세포 및 구조적 변화를 3D로 시각화하면 심혈관 연구에서 답이 없는 생물학적 질문을 더 잘 이해할 수 있는 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 시작하려면 마취된 마우스를 수술용 종이 타월로 덮인 폼 플레이트에 놓습니다. 접착 테이프를 사용하여 마우스의 팔과 다리를 누운 자세로 고정합니다.
75% 에탄올로 가슴을 소독하십시오. 1ml의 일회용 주사기를 사용하여 좌심실에서 혈액을 수집합니다. 그런 다음 가슴을 정중선으로 절개하고 오른쪽 심방을 작게 절개합니다.
혈액이 씻겨 나올 때까지 5분 동안 PBS에 10ml의 5mm몰 EDTA를 마우스의 좌심실에 관류한 다음 5-10분 동안 PBS 20ml를 관류합니다. 마지막으로 10ml의 4% 파라포름알데히드를 20분 동안 관류합니다. 해부 실체 현미경으로 위장 및 생식 기관을 포함한 내부 장기를 제거합니다.
심장, 대동맥, 신장은 그대로 두십시오. 그런 다음 흉선과 주변 지방 조직을 조심스럽게 제거합니다. 상행 대동맥에서 장골 분기점까지 전체 대동맥을 노출시킵니다.
대동맥 전체를 채취하여 PBS로 채워진 페트리 접시에 넣습니다. 대동맥을 다른 분절로 분리하고 두 개의 2, 2'티오디에탄올 또는 TDE 투명화를 위해 세로로 분할합니다. 대동맥 끝면을 Y자 모양의 평평한 검은색 왁스 플레이트에 고정하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 4%파라포름알데히드로 고정합니다.
다음 날, 대동맥의 고정을 풀고 PBS로 옮겨 5분 동안 씻습니다. 그런 다음 대동맥을 차단 용액으로 2시간 동안 옮겨 차단 및 투과화를 수행합니다. 다음으로, 차단 용액의 1차 항체와 함께 대동맥을 24시간 동안 배양합니다.
PBS에서 대동맥을 5분 동안 세척하고 5회 반복한 후 10% 일반 당나귀 혈청과 하룻밤 동안 핵 염색을 위한 DAPI의 2차 항체로 배양하고 염색된 대동맥을 TDE 용액의 농도를 증가시키는 것으로 옮깁니다. 다음으로, 양면 끈적한 직사각형 이미징 스페이서를 깨끗한 유리 슬라이드에 잘 붙이고 깨끗한 대동맥을 옮겨 끝면의 대동맥 외막이 커버 슬립을 향하도록 합니다. 60% TDE 용액 방울로 대동맥을 장착하고 기포를 방지하기 위해 덮개 슬립을 우물에 조심스럽게 부착합니다.
20x 오일 이멀젼 대물렌즈가 장착된 도립 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 켭니다. 염색 염료를 기반으로 하이브리드 다이오드 검출기를 조정합니다. 디스플레이 설정을 조정하고 이미징을 위해 1024x1024 픽셀 XY 형식을 선택합니다.
이머젼 오일을 커버 슬립에 떨어뜨리고 63x 대물렌즈를 s쪽으로 거칠게 움직입니다.amp이머젼 오일과 커버 슬립에 닿을 때까지. 그런 다음 관심 영역을 식별하고 3차원 이미징을 위해 2-4마이크로미터 스텝 크기에서 최대 60마이크로미터 깊이까지 끝면 대동맥의 외막 쪽에서 Z 스택을 획득합니다. 샘플 세부 정보 및 스캔 세부 정보를 사용하여 파일 이름을 지정하고 데이터를 저장합니다.
20x 대물렌즈가 장착된 정립 다광자 현미경을 사용하여 10-15마이크로미터 스텝 크기에서 최대 700마이크로미터 깊이까지 광단면에서 Z-스택을 획득합니다. PBS와 파라포름알데히드로 마우스를 마취하고 관류한 후 횡격막 수준 이상으로 신체 부위를 절개합니다. 하체 부위를 4%파라포름알데히드로 섭씨 4도에서 하루-이틀 동안 고정합니다.
다음으로, PBS에서 샘플을 10분 동안 3회 반복하여 철저히 세척합니다. 샘플을 20% 입방 용액에서 48시간 동안 배양합니다. PBS로 세척한 후 투과화 및 차단을 위해 PGST 용액에서 샘플을 밤새 배양합니다.
다음 날, 섭씨 4도의 PGST 용액에 1차 항체가 포함된 샘플을 10-12일 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. PGST에서 검체를 세척한 후 섭씨 4도에서 7일 동안 PGST의 DAPI에 2차 항체를 첨가합니다. PGST에서 샘플을 1시간 동안 5회 반복하여 철저히 세척합니다.
염색된 샘플을 탈수를 위해 일련의 증가된 농도의 테트라하이드로푸란 작업 용액으로 옮기고 농도당 12시간 동안 배양합니다. 탈수 후 지질 제거를 위해 샘플을 절대 디클로로메탄 용액에 3시간 동안 넣습니다. 다음으로, 벤질 알코올 벤질 벤조에이트 용액과 일치하는 굴절률에서 샘플을 3-6시간 동안 배양합니다.
먼저 마우스 대동맥 및 하체 부위 이미지의 Z 스택 타일 이미지를 이미지 처리 워크스테이션에 로드합니다. 세포 또는 구조의 부피 깊이를 색상 코드로 지정하려면 이미지 복원 소프트웨어를 사용하여 원시 이미지를 디콘볼루션합니다. Fiji 소프트웨어에서 시간 색상 코딩을 사용하여 디콘볼루션된 데이터의 최대 강도 투영을 생성합니다.
Z-스택 타일링 TIFF 이미지 시리즈를 소프트웨어에 로드합니다. 피지 스티칭 플러그인을 사용하여 이미지를 스티치하고 TIFF 형식으로 저장합니다. 다음으로, 이미지 분할을 위해 스티칭된 이미지를 3차원 시각화 소프트웨어에 로드합니다.
대동맥과 신경절 사이의 전체 경로를 따라 X-Y-Z 축의 신경 구조를 수동으로 추적합니다. 사전 처리된 이미지를 이미지 분석 소프트웨어에 로드합니다. 자가형광을 사용하여 대동맥과 결합 조직을 분할합니다.
뚜렷한 대동맥 벽과 플라크를 시각화하기 위해 별도의 pseudocolors를 적용합니다. 마지막으로, contrast-limited adaptive histogram equalization 함수를 사용하여 처리된 영상의 배경에 대한 국소 대비를 강화합니다. 제거된 TDE는 죽상경화성 대동맥을 통해 플라크에서 CD3e 염색된 T 세포를 발견했으며, 이는 동맥 제3 림프 기관에서 NF200 염색 신경 섬유의 광범위한 신생을 보여줍니다.
APOE 녹아웃 마우스에서 병든 복부 대동맥의 다광자 이미징은 동맥 제3 림프 기관 내에서 B220 양성 B 세포가 결핍된 영역에서 NF200 발현 축삭돌기가 싹을 틔우는 것을 보여주었습니다. iDISCO가 제거된 마우스 복부의 광시트 이미징은 죽상경화성 플라크에 인접한 외막에서 새로 형성된 NF200 염색 축삭돌이와 대동맥 사이의 공간적 관계를 시각화했습니다.
