El secretum del filtrado de cultivo de Mtb proporcionaría información sobre los factores de virulencia u otras proteínas secretadas por el patógeno para intervenciones terapéuticas. Aquí, estamos tratando de averiguar las proteínas secretadas por bacterias que darían una idea sobre el sistema de secreción de Mtb, sus factores de virulencia desconocidos y su impacto en la modulación del huésped para la supervivencia del patógeno dentro del huésped. En el campo de investigación de Mtb, medicamentos como la bedaquilina y la delamanida se pueden usar para tratar MDR y cepas externas.
Todavía se está investigando en el desarrollo de fármacos contra MDR y XDR, así como en vacunas contra el Mtb. El Mtb está adquiriendo cada vez más resistencia debido al incumplimiento de los regímenes farmacológicos. El tratamiento de las cepas MDR, XDR es la tarea más desafiante en el campo de la investigación de Mtb.
Nuestro grupo ha establecido múltiples hallazgos significativos en este campo. Nuestro laboratorio mostró el impacto de la fosforilación de CFP-10 en la virulencia de Mtb, y estableció la red de fosfo-proteoma, fosfo-secretum y secretum de Mtb. Además, un artículo del laboratorio ha demostrado que el secretor de SecA2 media el daño del ADN en el huésped.
El tratamiento de las células con proteínas filtradas en cultivo en lugar de bacterias cambia los niveles de citocinas y otros factores inmunomoduladores. Con la ayuda del estudio del secretum, se pueden identificar nuevos factores virulentos y su papel en la virulencia. Para comenzar, retire cuatro tallos independientes de glicerol Mtb a menos 80 grados centígrados y descongélelos a temperatura ambiente.
Vierta 10 mililitros de medio 7H9 que contenga un 10% de albúmina dextrosa catalasa en un matraz cónico de autoclave de 100 mililitros con tapón de rosca. Inocular todo el tallo de glicerol descongelado en los medios para revivir el cultivo que sirve como cultivo primario. Incubar el matraz de cultivo a 37 grados centígrados en un agitador de incubadora a 100 revoluciones por minuto durante tres o cuatro días.
Al quinto día, mida la absorbancia a 600 nanómetros. Cuando el cultivo alcance una densidad óptica entre 0,8 a uno, utilícelo para inocular el cultivo secundario en 100 mililitros de medio 7H9 que contenga 10% de ADC en un matraz de 500 mililitros. Cultive el cultivo secundario a 37 grados centígrados en un agitador de incubadora a 100 revoluciones por minuto durante dos o tres días.
Cuando la densidad óptica a 600 nanómetros alcance aproximadamente 0,8, extraiga 10 microlitros del cultivo con una pipeta con una punta de filtro y colóquelo en una placa de barrena LB sin antibióticos dentro de la campana bacteriana. Incube la placa a 37 grados centígrados durante 12 a 16 horas para verificar si hay contaminación bacteriana. Ahora inocule las bacterias del cultivo secundario libre de contaminación en 100 mililitros del medio de Sauton en un matraz de 500 mililitros.
Cultive el cultivo a 37 grados centígrados durante tres o cuatro días hasta que la densidad óptica alcance aproximadamente 0,8. Utilice el cultivo cultivado a una densidad óptica de aproximadamente 0,8 en el medio de Sauton para inocular nuevos cultivos de 300 mililitros para la preparación del filtrado. Para empezar, obtenga 300 mililitros de cultivo Mtb en fase logarítmica cultivado en los medios de Sauton.
Granule las células en un tubo de 50 mililitros a 2.100 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Con una pipeta serológica de 25 mililitros, transfiera 45 mililitros de sobrenadante a un tubo nuevo y deje el pellet intacto a un lado para la preparación del lisado de células completas. Repita el paso de centrifugación con el sobrenadante a 2,100 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Transfiera 40 mililitros del sobrenadante a un tubo nuevo, dejando cinco mililitros intactos. Ahora filtre el sobrenadante del cultivo con un filtro de jeringa de 0,2 micras en tubos nuevos. Inocular alícuotas de un mililitro del filtrado de cultivo en una placa de barrena e incubarlo a 37 grados centígrados durante cuatro semanas para comprobar si hay contaminación.
Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de 1X PBS G que contiene fluoruro de fenilmetilsulfonilo y 1X cóctel de inhibidores de proteasa. Transfiera el lisado a un tubo de rebordeo B con tapón de rosca de dos mililitros lleno hasta un tercio con perlas de circonio de 0,1 milímetros. Realice ocho ciclos de un minuto de batido de cuentas, seguidos de dos minutos de incubación en hielo.
Centrifugar el tubo a 18.000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 mililitros colocado sobre hielo. Después de repetir el paso de centrifugación, filtre el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros para eliminar la contaminación bacteriana patógena.
Almacene los lisados a menos 80 grados centígrados. Para comenzar, agregue 15 mililitros del filtrado de cultivo Mtb a una unidad de filtro centricón de tres kilokilos. Centrifugar el tubo a 2,100 G durante una hora a cuatro grados centígrados.
Repita el paso de centrifugación de 15 a 16 veces hasta que el filtrado de cultivo se reduzca a aproximadamente un mililitro. Alícuota 100 microlitros del cultivo concentrado filtran proteínas en 10 tubos de microcentrífuga de unión a proteínas bajas. Estimación de la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico.
Agregue 175 microlitros del reactivo mezclado según las instrucciones del fabricante. Después de mezclar las muestras, incubarlas a 37 grados centígrados durante una hora. Mida las lecturas de absorbancia a 562 nanómetros utilizando un lector ELISA.
