Le sécrètement du filtrat de culture de Mtb donnerait un aperçu des facteurs de virulence ou d’autres protéines sécrétées par l’agent pathogène pour des interventions thérapeutiques. Ici, nous essayons de découvrir les protéines sécrétées par les bactéries qui donneraient une idée du système de sécrétion de Mtb, de ses facteurs de virulence inconnus et de leur impact sur la modulation de l’hôte pour la survie de l’agent pathogène à l’intérieur de l’hôte. Dans le domaine de la recherche sur le Mtb, des médicaments comme la bédaquiline, le délamanide peuvent être utilisés pour traiter le MDR et les souches externes.
La recherche se poursuit pour développer des médicaments contre la MDR et la XDR, ainsi que des vaccins contre la Mtb. La Mtb acquiert de plus en plus de résistance en raison de l’inobservance des schémas thérapeutiques. Le traitement des souches MDR et XDR est la tâche la plus difficile dans le domaine de la recherche sur le Mtb.
Notre groupe a établi de multiples constatations importantes dans ce domaine. Notre laboratoire a montré l’impact de la phosphorylation de CFP-10 dans la virulence de Mtb et a établi le réseau phospho-protéome, phospho-sécrétum et sécrétum de Mtb. De plus, un article du laboratoire a montré que le sécréteur SecA2 médie les dommages à l’ADN chez l’hôte.
Le traitement des cellules avec des protéines filtrées par culture au lieu de bactéries modifie les niveaux de cytokines et d’autres facteurs immunomodulateurs. Avec l’aide de l’étude du sécrétum, on peut identifier de nouveaux facteurs virulents et leur rôle dans la virulence. Pour commencer, retirez quatre tiges de glycérol Mtb indépendantes à moins 80 degrés Celsius et décongelez-les à température ambiante.
Versez 10 millilitres de milieu 7H9 contenant 10 % d’albumine dextrose catalase dans une fiole conique autoclave de 100 millilitres avec un bouchon à vis. Inoculer toute la tige de glycérol décongelée dans le milieu pour raviver la culture qui sert de culture primaire. Incuber le ballon de culture à 37 degrés Celsius dans un agitateur d’incubation à 100 tours par minute pendant trois à quatre jours.
Le cinquième jour, mesurez l’absorbance à 600 nanomètres. Lorsque la culture atteint une densité optique comprise entre 0,8 et un, utilisez-la pour inoculer la culture secondaire dans 100 millilitres de milieu 7H9 contenant 10 % d’ADC dans une fiole de 500 millilitres. Cultivez la culture secondaire à 37 degrés Celsius dans un agitateur d’incubateur à 100 tours par minute pendant deux à trois jours.
Lorsque la densité optique à 600 nanomètres atteint environ 0,8, prélevez 10 microlitres de la culture à l’aide d’une pipette avec un embout filtrant et repérez-la sur une plaque de tarière LB sans antibiotiques à l’intérieur du capuchon bactérien. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures pour vérifier s’il y a une contamination bactérienne. Maintenant, inoculez les bactéries de la culture secondaire sans contamination dans 100 millilitres de milieu de Sauton dans une fiole de 500 millilitres.
Cultivez la culture à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre jours jusqu’à ce que la densité optique atteigne environ 0,8. Utilisez la culture cultivée à une densité optique d’environ 0,8 dans le milieu de Sauton pour inoculer de nouvelles cultures de 300 millilitres pour la préparation du filtrat. Pour commencer, procurez-vous 300 millilitres de culture de Mtb en phase logarithmique cultivée dans le milieu de Sauton.
Granulez les cellules dans un tube de 50 millilitres à 2,100 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une pipette sérologique de 25 millilitres, transférez 45 millilitres de surnageant dans un nouveau tube et mettez la pastille intacte de côté pour la préparation du lysat de cellules entières. Répétez l’étape de centrifugation avec le surnageant à 2,100 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Transférez 40 millilitres de surnageant dans un nouveau tube, en laissant cinq millilitres intacts. Filtrez maintenant le surnageant de culture à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 micron dans de nouveaux tubes. Inocutionnez des aliquotes d’un millilitre du filtrat de culture sur une plaque de vis sans fin et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant quatre semaines pour vérifier s’il n’y a pas de contamination.
Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de 1X PBS G contenant du fluorure de phénylméthylsulfonyle et 1X un cocktail d’inhibiteurs de protéase. Transférez le lysat dans un tube à perles à vis B de deux millilitres rempli au tiers de billes de zircone de 0,1 millimètre. Effectuez huit cycles d’une minute de battement de billes, suivi de deux minutes d’incubation sur glace.
Centrifugez le tube à 18 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Recueillir le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 millilitre placé sur de la glace. Après avoir répété l’étape de centrifugation, filtrez le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,2 micromètre pour éliminer la contamination bactérienne pathogène.
Conservez les lysats à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer, ajoutez 15 millilitres de filtrat de culture Mtb dans une unité de filtration centricon de trois kilodaltons. Centrifugez le tube à 2,100 G pendant une heure à quatre degrés Celsius.
Répétez l’étape de centrifugation 15 à 16 fois jusqu’à ce que le filtrat de culture réduise à environ un millilitre. Aliquote 100 microlitres de protéines de filtrat de culture concentrées dans 10 tubes de microcentrifugation à faible liaison protéique. Estimez la concentration en protéines à l’aide du kit de dosage des protéines d’acide bicinchoninique.
Ajouter 175 microlitres de réactif mélangé selon les instructions du fabricant. Après avoir mélangé les échantillons, incubez-les à 37 degrés Celsius pendant une heure. Mesurez les lectures d’absorbance à 562 nanomètres à l’aide d’un lecteur ELISA.
