O secretum do filtrado de cultura de Mtb daria informações sobre os fatores de virulência ou outras proteínas secretadas pelo patógeno para intervenções terapêuticas. Aqui, estamos tentando descobrir as proteínas secretadas por bactérias que dariam uma ideia sobre o sistema de secreção de Mtb, seus fatores de virulência desconhecidos e seu impacto na modulação do hospedeiro para a sobrevivência do patógeno dentro do hospedeiro. No campo de pesquisa do MTB, medicamentos como bedaquilina e delamanida podem ser usados para tratar MDR e cepas externas.
A pesquisa ainda está em andamento no desenvolvimento de medicamentos em MDR e XDR, e também vacinas para Mtb. O Mtb está adquirindo resistência cada vez mais devido à inconformidade com os regimes de medicamentos. Tratar as cepas MDR, XDR é a tarefa mais desafiadora no campo da pesquisa de Mtb.
Nosso grupo estabeleceu várias descobertas significativas neste campo. Nosso laboratório mostrou o impacto da fosforilação do CFP-10 na virulência do Mtb e estabeleceu a rede de fosfo-proteoma, fosfo-secreto e secreto do Mtb. Além disso, um artigo do laboratório mostrou que o secretor SecA2 medeia o dano ao DNA no hospedeiro.
O tratamento de células com proteínas filtradas por cultura em vez de bactérias altera os níveis de citocinas e outros fatores imunomoduladores. Com a ajuda do estudo secretum, pode-se identificar novos fatores virulentos e seu papel na virulência. Para começar, remova quatro talos independentes de glicerol Mtb de 80 graus Celsius negativos e descongele-os em temperatura ambiente.
Despeje 10 mililitros de meio 7H9 contendo 10% de albumina dextrose catalase em um frasco cônico de autoclave de 100 mililitros com tampa de rosca. Inocule todo o talo de glicerol descongelado no meio para reviver a cultura que serve como cultura primária. Incubar o balão de cultura a 37 graus Celsius num agitador incubador a 100 rotações por minuto durante três a quatro dias.
No quinto dia, medir a absorvância a 600 nanômetros. Quando a cultura atingir uma densidade óptica entre 0,8 a um, use-a para inocular a cultura secundária em 100 mililitros de meio 7H9 contendo 10% de ADC em um frasco de 500 mililitros. Cultive a cultura secundária a 37 graus Celsius em uma incubadora agitadora a 100 rotações por minuto por dois a três dias.
Quando a densidade óptica a 600 nanômetros atingir aproximadamente 0,8, retire 10 microlitros da cultura usando uma pipeta com ponta de filtro e coloque-a em uma placa de trado LB sem antibióticos dentro da coifa bacteriana. Incube a placa a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas para verificar se há contaminação bacteriana. Agora inocule as bactérias da cultura secundária livre de contaminação em 100 mililitros de meio de Sauton em um frasco de 500 mililitros.
Cultive a cultura a 37 graus Celsius por três a quatro dias até que a densidade óptica atinja aproximadamente 0,8. Use a cultura cultivada a uma densidade óptica de aproximadamente 0,8 no meio de Sauton para inocular novas culturas de 300 mililitros para preparação do filtrado. Para começar, obtenha 300 mililitros de cultura de Mtb em fase logarítmica cultivada no meio de Sauton.
Empurre as células para baixo em um tubo de 50 mililitros a 2.100 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Usando uma pipeta sorológica de 25 mililitros, transfira 45 mililitros de sobrenadante para um novo tubo e reserve o pellet intocado para a preparação do lisado de células inteiras. Repetir a etapa de centrifugação com o sobrenadante a 2,100 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius.
Transfira 40 mililitros do sobrenadante para um novo tubo, deixando cinco mililitros intocados. Agora filtre o sobrenadante de cultura usando um filtro de seringa de 0,2 mícron em novos tubos. Inocular alíquotas de um mililitro do filtrado de cultura numa placa helicoidal e incubá-la a 37 graus Celsius durante quatro semanas para verificar a existência de contaminação.
Ressuspenda o pellet em um mililitro de 1X PBS G contendo fluoreto de fenilmetilsulfonil e coquetel inibidor de protease 1X. Transfira o lisado para um tubo de contas B com tampa de rosca de dois mililitros preenchido até um terço com esferas de zircônia de 0,1 milímetros. Execute oito ciclos de um minuto de batida de contas, seguidos de dois minutos de incubação no gelo.
Centrifugar o tubo a 18 000 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Recolha o sobrenadante num novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros colocado sobre gelo. Depois de repetir a etapa de centrifugação, filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,2 micrômetro para eliminar a contaminação bacteriana patogênica.
Armazene os lisados a 80 graus Celsius negativos. Para começar, adicione 15 mililitros do filtrado de cultura Mtb a uma unidade de filtro centricon de três quilodaltons. Centrifugue o tubo a 2.100 G por uma hora a quatro graus Celsius.
Repetir a etapa de centrifugação 15 a 16 vezes até que o filtrado de cultura reduza para cerca de um mililitro. Alíquota de 100 microlitros das proteínas filtradas de cultura concentradas em 10 tubos de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas. Estime a concentração de proteínas usando o kit de ensaio de proteínas do ácido bicinconínico.
Adicione 175 microlitros do reagente misto de acordo com as instruções do fabricante. Depois de misturar as amostras, incube-as a 37 graus Celsius por uma hora. Meça as leituras de absorbância a 562 nanômetros usando um leitor ELISA.
