Mtb 배양 여과액의 분비는 치료 개입을 위해 병원체가 분비하는 독성 인자 또는 기타 단백질에 대한 통찰력을 제공합니다. 여기에서 우리는 Mtb의 분비 시스템, 알려지지 않은 독성 요인 및 숙주 내부의 병원체의 생존을 위한 숙주 조절에 미치는 영향에 대한 아이디어를 제공할 박테리아 분비 단백질을 찾으려고 합니다. Mtb 연구 분야에서는 베다퀼린(bedaquiline), 델라마니드(delamaid)와 같은 약물을 사용하여 MDR 및 외부 균주를 치료할 수 있습니다.
MDR 및 XDR에 대한 약물 개발에 대한 연구가 계속 진행 중이며, Mtb에 대한 백신도 개발되고 있습니다. Mtb는 약물 요법의 불이행으로 인해 점점 더 내성을 획득하고 있습니다. MDR, XDR 균주를 치료하는 것은 Mtb 연구 분야에서 가장 어려운 작업입니다.
우리 그룹은 이 분야에서 여러 가지 중요한 결과를 확립했습니다. 본 연구실에서는 CFP-10의 인산화가 Mtb 독성에 미치는 영향을 보여주었으며, Mtb의 phospho-proteome, phospho-secretum 및 secretum network를 확립하였습니다. 또한 연구실의 논문에 따르면 SecA2 secretor가 숙주의 DNA 손상을 매개한다고 밝혔습니다.
박테리아 대신 배양으로 여과된 단백질로 세포를 치료하면 사이토카인 수치 및 기타 면역 조절 인자에 변화가 생깁니다. 분비 연구의 도움으로 새로운 악성 요인과 독성에 대한 그들의 역할을 식별할 수 있습니다. 먼저 영하 80도에서 4개의 독립적인 Mtb 글리세롤 줄기를 제거하고 실온에서 해동합니다.
10% 알부민 포도당 카탈라아제를 함유한 10mL의 7H9 배지를 나사 캡이 있는 100ml 오토클레이브 원추형 플라스크에 붓습니다. 해동된 글리세롤 줄기 전체를 배지에 접종하여 1차 배양 역할을 하는 배양을 되살립니다. 배양 플라스크를 섭씨 37도의 인큐베이터 셰이커에서 3-4일 동안 분당 100회 회전으로 배양합니다.
다섯째 날에는 600나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 배양액이 0.8 대 1 사이의 광학 밀도에 도달하면 이를 사용하여 500ml 플라스크에 10% ADC를 함유한 100mL의 7H9 배지에 2차 배양을 접종합니다. 섭씨 37도의 인큐베이터 쉐이커에서 2-3일 동안 분당 100회 회전하는 2차 배양을 성장시킵니다.
600나노미터의 광학 밀도가 약 0.8에 도달하면 필터 팁이 있는 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 배양물을 회수하고 박테리아 후드 내부의 항생제가 없는 LB 오거 플레이트에 묻습니다. 세균 오염 여부를 확인하기 위해 섭씨 37도에서 12-16시간 동안 플레이트를 배양합니다. 이제 오염이 없는 2차 배양액의 박테리아를 500ml 플라스크에 담긴 100ml의 Sauton 배지에 접종합니다.
광학 밀도가 약 0.8에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 3-4일 동안 배양물을 성장시킵니다. Sauton의 배지에서 약 0.8의 광학 밀도로 성장한 배양액을 사용하여 여과액 준비를 위한 새로운 300ml 배양액을 접종합니다. 시작하려면 Sauton의 배지에서 성장한 300ml의 로그 위상 Mtb 배양을 얻습니다.
50밀리리터 튜브에 담긴 세포를 섭씨 4도에서 10분 동안 2, 100G로 펠릿 다운합니다. 25ml 혈청학 피펫을 사용하여 45ml의 상층액을 새 튜브로 옮기고 전체 세포 용해물 준비를 위해 손대지 않은 펠릿을 따로 보관합니다. 2, 100G에서 상등액으로 원심분리 단계를 섭씨 4도에서 10분 동안 반복합니다.
40ml의 상등액을 새 튜브로 옮기고 5ml는 그대로 둡니다. 이제 0.2미크론 주사기 필터를 사용하여 배양 상층액을 새 튜브에 여과합니다. 배양 여과액의 1ml 분취액을 오거 플레이트에 접종하고 섭씨 37도에서 4주 동안 배양하여 오염 여부를 확인합니다.
페닐메틸설포닐 플루오라이드를 함유한 1X PBS G 1밀리리터와 1X 프로테아제 억제제 칵테일에 펠릿을 재현탁합니다. 용해물을 0.1mm 지르코니아 비드로 1/3로 채워진 2밀리리터 나사 캡 B 구슬 튜브로 옮깁니다. 1분 동안 구슬을 치는 8사이클을 수행한 다음 얼음 위에서 2분 동안 배양합니다.
18, 000G에서 섭씨 4도에서 15분 동안 튜브를 원심분리하십시오. 얼음 위에 놓인 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 상층액을 모읍니다. 원심분리 단계를 반복한 후 0.2마이크로미터 주사기 필터를 통해 상층액을 여과하여 병원성 박테리아 오염을 제거합니다.
용해물은 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 먼저 15ml의 Mtb 배양 여과액을 3킬로달톤 중심형 필터 장치에 추가합니다. 튜브를 섭씨 2도에서 100G로 1시간 동안 원심분리합니다.
배양 여과액이 약 1ml로 감소할 때까지 원심분리 단계를 15-16회 반복합니다. 농축된 배양 여과액 단백질 100마이크로리터를 10개의 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다. bicinchoninic acid protein assay kit를 사용하여 단백질 농도를 추정합니다.
제조업체의 지침에 따라 혼합 시약 175마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 혼합한 후 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. ELISA 리더를 사용하여 562나노미터에서 흡광도 판독값을 측정합니다.
