Mtb培養濾液の分泌物は、病原体によって分泌される病原性因子または他のタンパク質に対する洞察を与え、治療的介入を行います。ここでは、Mtbの分泌系、その未知の病原性因子、および宿主内の病原体の生存に対する宿主調節への影響についてのアイデアを与える細菌分泌タンパク質を見つけようとしています。Mtbの研究分野では、ベダキリン、デラマニドなどの薬剤をMDRや外部株の治療に使用できます。
MDRとXDRの薬の開発、そしてMtbのワクチンの開発についてはまだ研究が続いています。MDR、XDR株の治療は、Mtb研究の分野で最も困難な課題です。
私たちのグループは、この分野で複数の重要な発見を確立しました。私たちの研究室では、CFP-10のリン酸化がMtbの病原性に与える影響を示し、Mtbのリン酸化プロテオーム、リン酸化分泌物、および分泌物ネットワークを確立しました。
細菌の代わりに培養ろ過タンパク質で細胞を処理すると、サイトカインレベルやその他の免疫調節因子が変化します。secretum研究の助けを借りて、新しい毒性因子とそれらの病原性における役割を特定することができます。まず、マイナス80°Cから4本の独立したMtbグリセリン茎を取り除き、室温で解凍します。
10%アルブミンデキストロースカタラーゼを含む10ミリリットルの7H9培地を、スクリューキャップ付きの100ミリリットルのオートクレーブ円錐フラスコに注ぎます。解凍したグリセリン茎全体を培地に接種し、一次培養物である培養物を蘇らせます。培養フラスコをインキュベーターシェーカーで摂氏37度で毎分100回転で3〜4日間インキュベートします。
5日目に、600ナノメートルで吸光度を測定します。培養物が0.8〜1の光学密度に達したら、それを使用して、500ミリリットルのフラスコに10%ADCを含む100ミリリットルの7H9培地で二次培養物を接種します。二次培養物を摂氏37度でインキュベーターシェーカーで毎分100回転で2〜3日間増殖させます。
600ナノメートルの光学密度が約0.8に達したら、フィルターチップ付きのピペットを使用して培養物の10マイクロリットルを引き出し、細菌フード内の抗生物質を含まないLBオーガープレートでスポットします。プレートを摂氏37度で12〜16時間インキュベートして、細菌汚染がないか確認します。次に、汚染のない二次培養から、500ミリリットルのフラスコに入った100ミリリットルのSauton培地に細菌を接種します。
光学密度が約0.8に達するまで、37°Cで3〜4日間培養します。Sautonの培地で約0.8の光学密度に成長させた培養物を使用して、濾液調製用の新しい300ミリリットルの培養物を接種します。まず、Sautonの培地で成長させた300ミリリットルの対数期Mtb培養液を入手します。
50ミリリットルのチューブ内の細胞を2,100Gで4°Cで10分間ペレット化します。25ミリリットルの血清ピペットを使用して、45ミリリットルの上清を新しいチューブに移し、手つかずのペレットを全細胞ライセート調製のために取っておきます。上清を2,100Gにして、摂氏4度で10分間遠心分離ステップを繰り返します。
上清40ミリリットルを新しいチューブに移し、5ミリリットルをそのままにします。次に、0.2ミクロンのシリンジフィルターを使用して培養上清を新しいチューブにろ過します。培養液の1ミリリットルのアリコートをオーガープレートに接種し、摂氏37度で4週間インキュベートして汚染を確認します。
フェニルメチルスルホニルフルオリドを含む1X PBS Gと1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルの1ミリリットルにペレットを再懸濁します。ライセートを、0.1ミリメートルのジルコニアビーズで3分の1まで充填された2ミリリットルのスクリューキャップBビーズチューブに移します。1分間のビーズビーキングを8サイクル行い、続いて氷上で2分間のインキュベーションを行います。
チューブを18, 000Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。上清を氷の上に置いた新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。遠心分離ステップを繰り返した後、0.2マイクロメートルのシリンジフィルターで上清をろ過し、病原性細菌汚染を排除します。
ライセートは摂氏マイナス80度で保管します。まず、15ミリリットルのMtb培養濾液を3キロダルトンのセントリコンフィルターユニットに加えます。チューブを2,100Gで4°Cで1時間遠心分離します。
培養濾液が約1ミリリットルに減少するまで、遠心分離ステップを15〜16回繰り返します。濃縮培養液タンパク質100マイクロリットルを10本の低タンパク質結合微量遠心チューブに分注します。ビシンコニン酸タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を推定します。
製造元の指示に従って、175マイクロリットルの混合試薬を追加します。サンプルを混合した後、摂氏37度で1時間インキュベートします。ELISAリーダーを使用して、562ナノメートルの吸光度測定値を測定します。
