Il secretum del filtrato di coltura di Mtb fornirebbe informazioni sui fattori di virulenza o su altre proteine secrete dal patogeno per interventi terapeutici. Qui, stiamo cercando di scoprire le proteine batteriche secrete che darebbero un'idea del sistema di secrezione di Mtb, dei suoi fattori di virulenza sconosciuti e del loro impatto sulla modulazione dell'ospite per la sopravvivenza del patogeno all'interno dell'ospite. Nel campo della ricerca Mtb, farmaci come la bedaquilina, il delamanid possono essere utilizzati per il trattamento dell'MDR e dei ceppi esterni.
La ricerca è ancora in corso sullo sviluppo di farmaci su MDR e XDR, e anche di vaccini per la Mtb. La Mtb sta acquisendo sempre più resistenza a causa della non conformità dei regimi farmacologici. Il trattamento dei ceppi MDR, XDR è il compito più impegnativo nel campo della ricerca sulla Mtb.
Il nostro gruppo ha stabilito molteplici risultati significativi in questo campo. Il nostro laboratorio ha dimostrato l'impatto della fosforilazione di CFP-10 nella virulenza di Mtb e ha stabilito la rete di fosfo-proteoma, fosfo-secreto e secreto di Mtb. Inoltre, un articolo del laboratorio ha dimostrato che il secretore SecA2 media il danno al DNA nell'ospite.
Il trattamento delle cellule con proteine filtrate in coltura invece che con batteri modifica i livelli di citochine e altri fattori immunomodulatori. Con l'aiuto dello studio del secretum, è possibile identificare nuovi fattori virulenti e il loro ruolo nella virulenza. Per iniziare, rimuovi quattro gambi indipendenti di glicerolo Mtb da meno 80 gradi Celsius e scongelali a temperatura ambiente.
Versare 10 millilitri di terreno 7H9 contenente il 10% di albumina destrosio catalasi in un pallone conico per autoclave da 100 millilitri con tappo a vite. Inoculare l'intero gambo di glicerolo scongelato nel terreno per far rivivere la coltura che funge da coltura primaria. Incubare il pallone di coltura a 37 gradi Celsius in un agitatore per incubatrice a 100 giri al minuto per tre o quattro giorni.
Il quinto giorno, misurare l'assorbanza a 600 nanometri. Quando la coltura raggiunge una densità ottica compresa tra 0,8 e uno, utilizzarla per inoculare la coltura secondaria in 100 millilitri di terreno 7H9 contenente il 10% di ADC in un pallone da 500 millilitri. Coltiva la coltura secondaria a 37 gradi Celsius in un agitatore per incubatrice a 100 giri al minuto per due o tre giorni.
Quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge circa 0,8, prelevare 10 microlitri di coltura utilizzando una pipetta con puntale filtrante e posizionarla su una coclea LB senza antibiotici all'interno della cappa batterica. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 12-16 ore per verificare la presenza di contaminazioni batteriche. Ora inoculare i batteri dalla coltura secondaria priva di contaminazione in 100 millilitri di terreno di Sauton in un pallone da 500 millilitri.
Coltiva la coltura a 37 gradi Celsius per tre o quattro giorni fino a quando la densità ottica raggiunge circa 0,8. Utilizzare la coltura coltivata a una densità ottica di circa 0,8 nel terreno di Sauton per inoculare nuove colture da 300 millilitri per la preparazione del filtrato. Per iniziare, ottieni 300 millilitri di coltura Mtb in fase logaritmica coltivata nei terreni di Sauton.
Pellettare le celle in un tubo da 50 millilitri a 2,100 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando una pipetta sierologica da 25 millilitri, trasferire 45 millilitri di surnatante in una nuova provetta e mettere da parte il pellet intatto per la preparazione del lisato a cellule intere. Ripetere la fase di centrifugazione con il surnatante a 2, 100 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Trasferire 40 millilitri di surnatante in un nuovo tubo, lasciando intatti cinque millilitri. Filtrare ora il surnatante di coltura utilizzando un filtro per siringa da 0,2 micron in nuove provette. Inoculare aliquote da un millilitro del filtrato di coltura su una piastra a coclea e incubarla a 37 gradi Celsius per quattro settimane per verificare la presenza di contaminazione.
Risospendere il pellet in un millilitro di 1X PBS G contenente fluoruro di fenilmetilsulfonile e 1X cocktail di inibitori della proteasi. Trasferire il lisato in un tubo per perline B con tappo a vite da due millilitri riempito per un terzo con perle di zirconia da 0,1 millimetri. Eseguire otto cicli di un minuto di battitura delle perline, seguiti da due minuti di incubazione su ghiaccio.
Centrifugare la provetta a 18.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in una provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 millilitri posta sul ghiaccio. Dopo aver ripetuto la fase di centrifugazione, filtrare il surnatante attraverso un filtro a siringa da 0,2 micrometri per eliminare la contaminazione batterica patogena.
Conservare i lisati a meno 80 gradi Celsius. Per iniziare, aggiungi 15 millilitri di filtrato di coltura Mtb a un'unità filtrante centricon da tre kilodalton. Centrifugare la provetta a 2,100 g per un'ora a quattro gradi Celsius.
Ripetere la fase di centrifugazione da 15 a 16 volte fino a quando il filtrato di coltura non si riduce a circa un millilitro. Aliquotare 100 microlitri di proteine filtrate da coltura concentrata in 10 provette per microcentrifuga a basso legame proteico. Stimare la concentrazione proteica utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinconinnico.
Aggiungere 175 microlitri di reagente miscelato secondo le istruzioni del produttore. Dopo aver mescolato i campioni, incubarli a 37 gradi Celsius per un'ora. Misura le letture dell'assorbanza a 562 nanometri utilizzando un lettore ELISA.
