Mtb kültür filtratının sekretumu, terapötik müdahaleler için patojen tarafından salgılanan virülans faktörleri veya diğer proteinler hakkında fikir verecektir. Burada, Mtb'nin salgı sistemi, bilinmeyen virülans faktörleri ve bunların konak içindeki patojenin hayatta kalması için konak modülasyonu üzerindeki etkileri hakkında fikir verecek bakteri salgılanan proteinleri bulmaya çalışıyoruz. Mtb araştırma alanında, MDR ve dış suşları tedavi etmek için bedaquilin, delamanid gibi ilaçlar kullanılabilir.
MDR ve XDR ile ilgili ilaçların geliştirilmesi ve ayrıca Mtb için aşıların geliştirilmesi üzerine araştırmalar devam etmektedir. Mtb, ilaç rejimlerinin uyumsuzluğu nedeniyle giderek daha fazla direnç kazanmaktadır. MDR, XDR suşlarını tedavi etmek, Mtb araştırması alanındaki en zorlu görevdir.
Grubumuz bu alanda çok sayıda önemli bulgu ortaya koymuştur. Laboratuvarımız, CFP-10'un fosforilasyonunun Mtb virülansındaki etkisini gösterdi ve Mtb'nin fosfo-proteom, fosfo-sekretum ve sekretum ağını kurdu. Ek olarak, laboratuvardan gelen bir makale, SecA2 sekretörünün konakçıdaki DNA hasarına aracılık ettiğini göstermiştir.
Hücrelerin bakteri yerine kültürle filtrelenmiş proteinlerle tedavi edilmesi, sitokin seviyelerini ve diğer immünomodülatör faktörleri değiştirir. Sekretum çalışmasının yardımıyla, yeni virülan faktörler ve bunların virülanstaki rolü tanımlanabilir. Başlamak için, dört bağımsız Mtb gliserol sapını eksi 80 santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığında çözün.
% 10 albümin dekstroz katalaz içeren 10 mililitre 7H9 ortamını vidalı kapaklı 100 mililitrelik otoklav konik bir şişeye dökün. Birincil kültür olarak hizmet eden kültürü canlandırmak için çözülmüş gliserol sapının tamamını medyaya aşılayın. Kültür şişesini 37 santigrat derecede bir inkübatör çalkalayıcıda dakikada 100 devirde üç ila dört gün boyunca inkübe edin.
Beşinci günde, absorbansı 600 nanometrede ölçün. Kültür, 0,8 ila bir arasında bir optik yoğunluğa ulaştığında, ikincil kültürü 500 mililitrelik bir şişede% 10 ADC içeren 10 mililitre 7H9 ortamında aşılamak için kullanın. İkincil kültürü, iki ila üç gün boyunca dakikada 100 devirde bir inkübatör çalkalayıcıda 37 santigrat derecede büyütün.
600 nanometredeki optik yoğunluk yaklaşık 0.8'e ulaştığında, filtre uçlu bir pipet kullanarak kültürün 10 mikrolitresini çekin ve bakteri başlığının içinde antibiyotik olmayan bir LB burgu plakasına yerleştirin. Bakteriyel kontaminasyonu kontrol etmek için plakayı 37 santigrat derecede 12 ila 16 saat inkübe edin. Şimdi bakterileri kontaminasyonsuz ikincil kültürden 500 mililitrelik bir şişede 100 mililitre Soton'un ortamına aşılayın.
Optik yoğunluk yaklaşık 0,8'e ulaşana kadar kültürü üç ila dört gün boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Süzüntü hazırlığı için yeni 300 mililitrelik kültürleri aşılamak için Soton'un ortamında yaklaşık 0.8'lik bir optik yoğunluğa kadar büyütülen kültürü kullanın. Başlamak için, Sauton'un ortamında yetiştirilen 300 mililitre log faz Mtb kültürü elde edin.
Hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte 2, 100 G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca peletleyin. 25 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, 45 mililitre süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve el değmemiş peleti tüm hücre lizat hazırlığı için bir kenara koyun. Santrifüjleme adımını süpernatan ile 2, 100 G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca tekrarlayın.
Süpernatanın 40 mililitresini yeni bir tüpe aktarın ve beş mililitreyi el değmeden bırakın. Şimdi 0.2 mikronluk bir şırınga filtresi kullanarak kültür süpernatantını yeni tüplere filtreleyin. Kültürün bir mililitrelik alikotlarını bir burgu plakasına süzülün ve kontaminasyonu kontrol etmek için dört hafta boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Pelet, fenilmetilsülfonil florür ve 1X proteaz inhibitör kokteyli içeren bir mililitre 1X PBS G'de yeniden süspanse edin. Lizatı, üçte birine kadar 0.1 milimetre zirkonya boncuklarla doldurulmuş iki mililitrelik vidalı kapaklı B boncuk tüpüne aktarın. Bir dakikalık boncuk çırpma işleminin sekiz döngüsünü gerçekleştirin, ardından buz üzerinde iki dakikalık inkübasyon yapın.
Tüpü 18.000 G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı buz üzerine yerleştirilmiş 1.5 mililitrelik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Santrifüjleme adımını tekrarladıktan sonra, patojenik bakteriyel kontaminasyonu ortadan kaldırmak için süpernatanı 0,2 mikrometrelik bir şırınga filtresinden süzün.
Lizatları eksi 80 santigrat derecede saklayın. Başlamak için, üç kilodaltonluk bir santrifüj filtre ünitesine 15 mililitre Mtb kültür süzüntüsü ekleyin. Tüpü dört santigrat derecede bir saat boyunca 2, 100 G'de santrifüjleyin.
Kültür süzüntüsü yaklaşık bir mililitreye düşene kadar santrifüjleme adımını 15 ila 16 kez tekrarlayın. Konsantre kültürün 100 mikrolitresi, proteinleri 10 düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne süzün. Bikinkoninik asit protein tahlil kitini kullanarak protein konsantrasyonunu tahmin edin.
Üreticinin talimatlarına göre 175 mikrolitre karışık reaktif ekleyin. Numuneleri karıştırdıktan sonra, bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir ELISA okuyucu kullanarak 562 nanometrede absorbans okumalarını ölçün.
