ההפרשה של תסנין תרבית Mtb תיתן תובנה לגבי גורמי האלימות או חלבונים אחרים המופרשים על ידי הפתוגן להתערבויות טיפוליות. כאן, אנו מנסים לגלות את החלבונים המופרשים על ידי חיידקים שייתנו מושג על מערכת ההפרשה של Mtb, גורמי האלימות הלא ידועים שלה, והשפעתם על אפנון המארח להישרדות הפתוגן בתוך המארח. בתחום המחקר של Mtb, ניתן להשתמש בתרופות כמו בדקווילין, דלמניד לטיפול ב-MDR וזנים חיצוניים.
המחקר עדיין נמשך על פיתוח תרופות על MDR ו-XDR, וגם חיסונים ל-Mtb. Mtb רוכש עמידות יותר ויותר בגלל חוסר התאימות של משטרי התרופות. הטיפול בזני ה-MDR, XDR הוא המשימה המאתגרת ביותר בתחום מחקר ה-Mtb.
הקבוצה שלנו ביססה מספר ממצאים משמעותיים בתחום זה. המעבדה שלנו הראתה את ההשפעה של זרחון CFP-10 על אלימות Mtb, והקימה את רשת הפוספו-פרוטאום, הפוספו-הפרשה וההפרשה של Mtb. בנוסף, מאמר מהמעבדה הראה כי מפריש ה-SecA2 מתווך את נזק ה-DNA במארח.
טיפול בתאים עם חלבונים מסוננים בתרבית במקום חיידקים משנה את רמות הציטוקינים וגורמים אימונומודולטוריים אחרים. בעזרת מחקר הפרשה ניתן לזהות גורמים אלימים חדשים ותפקידם באלימות. כדי להתחיל, הסר ארבעה גבעולי גליצרול Mtb עצמאיים ממינוס 80 מעלות צלזיוס והפשיר אותם בטמפרטורת החדר.
יוצקים 10 מיליליטר של מדיום 7H9 המכיל 10% אלבומין דקסטרוז קטלאז לבקבוק חרוטי חיטוי של 100 מיליליטר עם מכסה בורג. חסנו את כל גבעול הגליצרול המופשר למדיה כדי להחיות את התרבות המשמשת כתרבות העיקרית. דגרו את בקבוק התרבות ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר אינקובטור ב-100 סיבובים לדקה למשך שלושה עד ארבעה ימים.
ביום החמישי יש למדוד את הספיגה ב-600 ננומטר. כאשר התרבית מגיעה לצפיפות אופטית בין 0.8 ל-1, השתמש בה כדי לחסן את התרבית המשנית ב-100 מיליליטר של מדיום 7H9 המכיל 10% ADC בבקבוק של 500 מיליליטר. גדל את התרבות המשנית ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר אינקובטור ב-100 סיבובים לדקה למשך יומיים-שלושה.
כאשר הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה לכ-0.8, משוך 10 מיקרוליטר מהתרבית באמצעות פיפטה עם קצה מסנן, ואתר אותה על צלחת מקדחה LB ללא אנטיביוטיקה בתוך מכסה המנוע של החיידקים. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות כדי לבדוק אם יש זיהום חיידקי. כעת חסנו את החיידקים מהתרבית המשנית נטולת הזיהום לתוך 100 מיליליטר של המדיום של סאוטון בבקבוק של 500 מיליליטר.
מגדלים את התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה ימים עד שהצפיפות האופטית מגיעה לכ-0.8. השתמש בתרבית שגדלה לצפיפות אופטית של כ-0.8 במדיום של סאוטון כדי לחסן תרביות חדשות של 300 מיליליטר להכנת סינון. כדי להתחיל, השג 300 מיליליטר של תרבית Mtb שלב לוג שגדלה במדיה של סאוטון.
גלולה את התאים בצינור של 50 מיליליטר ב -2, 100 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בעזרת פיפטה סרולוגית של 25 מיליליטר, העבירו 45 מיליליטר של סופרנטנט לצינור חדש, והניחו את הכדור שלא נגעו בו בצד להכנת ליזאט תא שלם. חזור על שלב הצנטריפוגה עם הסופרנטנט ב -2, 100 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
העבירו 40 מיליליטר של הסופרנטנט לצינור חדש, והשאירו חמישה מיליליטר ללא מגע. כעת סנן את חומר התרבות באמצעות מסנן מזרק של 0.2 מיקרון לצינורות חדשים. יש לחסן כמות של מיליליטר אחד של התרבית המסוננת על צלחת מקדחה, ולדגור אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבעה שבועות כדי לבדוק אם יש זיהום.
השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של 1X PBS G המכיל פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד, וקוקטייל מעכב פרוטאז 1X. העבירו את הליזאט לצינור חרוזי B של מכסה בורג של שני מיליליטר מלא לשליש עם חרוזי זירקוניה של 0.1 מילימטרים. בצע שמונה מחזורים של דקה אחת של הכאת חרוזים, ולאחר מכן שתי דקות של דגירה על קרח.
צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורה של 18, 000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אספו את הסופרנטנט לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר המונח על קרח. לאחר חזרה על שלב הצנטריפוגה, סנן את הסופרנטנט דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר כדי למנוע זיהום חיידקי פתוגני.
אחסן את הליזטים במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל, הוסף 15 מיליליטר של תסנין תרבית Mtb ליחידת פילטר צנטריקון של שלושה קילודלטון. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורה של 2, 100 גרם למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס.
חזור על שלב הצנטריפוגה 15 עד 16 פעמים עד שתסנין התרבית מצטמצם לכמיליליטר אחד. Aliquot 100 מיקרוליטר של התרבית המרוכזת מסננים חלבונים ל-10 צינורות מיקרו-צנטריפוגה קושרים חלבון נמוך. הערך את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון חומצה ביצינצ'ונינית.
הוסף 175 מיקרוליטר של המגיב המעורב לפי הוראות היצרן. לאחר ערבוב הדגימות, דגרו אותן בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. מדוד קריאות ספיגה ב-562 ננומטר באמצעות קורא ELISA.
