Souris cellules épithéliales mammaires forme Mammospheres cours de la différenciation lactogène

Résumé

HC11 différentiation lactogène peut être caractérisée par la formation de structures en forme de dôme appelé mammospheres. Les structures peuvent être énumérés par microscopie à contraste de phase afin d'aider à quantifier différentiation lactogène.

Résumé

Une mesure phénotypique communément utilisé pour déterminer le degré de différenciation dans le lactogène mammaire de la souris des cultures de cellules épithéliales est la formation de structures cellulaires en forme de dôme appelé mammospheres

Protocole

1. Le HC11 cellules ont été cultivées à confluence pendant 6 jours en milieu RPMI 1640 complété avec du sérum de veau foetal à 10%, l'insuline 5μg/ml, HEPES 10 mM, 10ng/ml de facteur de croissance épidermique (EGF) pour établir la compétence.
2. Les cellules ont été lavées avec du PBS et maintenus dans un milieu de croissance sans EGF pendant 24 heures.
3. Pour induire la différenciation lactogène les cellules sont incubées dans les médias de différenciation, c'est à dire RPMI avec la dexaméthasone (10 ^-6 M), l'insuline (5 ug / ml) et la prolactine (5 ug / ml) appelé DIP.
4. A la fois affirmé après-DIP outre, mammospheres ont été photographiés et énumérés par microscopie à contraste de phase en utilisant un Olympus IX71 microscope avec appareil photo numérique.

Les résultats représentatifs:

Faible grossissement des monocouches de cellules mammaires normales épithéliales et mammospheres multiples, ainsi que de grossissement de haute puissance d'une seule mammosphere sont présentés dans la figure 1, respectivement.


Figure 1. Mammospheres. (A) mammaire normale monocouches de cellules épithéliales devrait être affichée comme une couche plane de cellules confluentes. (B) Après 3-5 jours de la stimulation DIP mammospheres multiples apparaissent. Photographie prise cinq jours après DIP addition. (C) Plus fort grossissement d'un champ unique contenant mammospheres à 5 jours après l'ajout DIP.

Discussion

Pour que cette technique soit réussie et de la meilleure qualité, les cellules épithéliales doivent être maintenues à confluence avant d'être induites par des hormones lactogènes. Il peut y avoir des situations où il ya de nombreuses mammospheres, ce qui rend la quantification difficile. Ainsi, à des fins quantitatives, il est préférable de photographier les mammospheres à un point alors que le nombre de mammospheres est capable d'être comptés.

Bien qu'il existe di...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Invitrogen	21870076
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030
PenStrep	GIBCO, by Life Technologies	15140
Hepes	Quality Biological, Inc.	118089060
EGF	Sigma-Aldrich	E9644
Insulin	GIBCO, by Life Technologies	12585-014
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
Microscope	Olympus Corporation	IX71
Digital Camera	QImaging	Retiga 2000RV Fast 1394