Rato células epiteliais mamárias forma Mammospheres durante a diferenciação lactogênica

Resumo

HC11 lactogênica diferenciação pode ser caracterizada pela formação de estruturas de cúpula referido como mammospheres. As estruturas podem ser enumerados por microscopia de contraste de fase para ajudar a quantificar a diferenciação lactogênese.

Resumo

Uma medida fenotípicas comumente usado para determinar o grau de diferenciação do mouse em lactogênica mamárias culturas de células epiteliais é a formação de estruturas celulares em forma de cúpula referido como mammospheres

Protocolo

1. O HC11 células foram cultivadas a confluência de seis dias em meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%, insulina 5μg/ml, 10 mM HEPES, fator de crescimento 10ng/ml epidérmico (EGF) para estabelecer competência.
2. As células foram lavadas com PBS e mantidos em meio de crescimento sem EGF por 24 horas.
3. Para induzir a diferenciação lactogênica as células foram incubadas em meios de diferenciação, isto é, RPMI com dexametasona (10 ^-6 M), a insulina (5 mg / ml) e prolactina (5 mg / ml) conhecido como DIP.
4. No horário mencionado além de pós-DIP, mammospheres foram fotografados e enumerados por microscopia de contraste de fase utilizando um microscópio Olympus IX71 com câmera digital.

Resultados representativos:

Ampliação de baixa potência do normal mamárias monocamadas de células epiteliais e mammospheres múltiplos, bem como de ampliação de alta potência de uma única mammosphere são mostrados na Figura 1, respectivamente.


Figura 1. Mammospheres. (A) Normal monocamadas de células epiteliais mamárias deve ser exibido como uma camada plana de células confluentes. (B) Após 3-5 dias de DIP estimulação mammospheres múltiplas aparecer. Fotografia tirada 5 dias pós-DIP disso. (C) Maior aumento de um único campo contendo mammospheres a 5 dias após o DIP disso.

Discussão

Para que esta técnica seja bem sucedida e da melhor qualidade, as células epiteliais deve ser mantida a confluência antes de ser induzidos com hormônios lactogênese. Pode haver situações em que há mammospheres numerosas, o que torna a quantificação difícil. Assim, para fins quantitativos, é melhor para fotografar a mammospheres em um ponto de tempo quando o número de mammospheres é capaz de ser contado.

Embora existam diversos marcadores moleculares utilizados para determinar o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Invitrogen	21870076
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030
PenStrep	GIBCO, by Life Technologies	15140
Hepes	Quality Biological, Inc.	118089060
EGF	Sigma-Aldrich	E9644
Insulin	GIBCO, by Life Technologies	12585-014
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
Microscope	Olympus Corporation	IX71
Digital Camera	QImaging	Retiga 2000RV Fast 1394