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Expériences d'immunoprécipitation SILAC représentent un puissant moyen de découvrir de nouvelles interactions protéine: protéine. En permettant la quantification relative exacte de l'abondance de la protéine à la fois le contrôle et les échantillons de test, les interactions véritables peut être facilement distinguée de contaminants expérimentales, et les interactions de faible affinité préservée grâce à l'utilisation de conditions de tampon moins rigoureuses.
Protéomique quantitative combinées avec purification immuno-affinité, SILAC immunoprécipitation, représentent un moyen puissant pour la découverte de nouvelles interactions protéine: protéine. En permettant la quantification relative exacte de l'abondance de la protéine à la fois le contrôle et les échantillons de test, les interactions véritables peuvent être aisément distinguées des contaminants expérimentales. Interactions de faible affinité peuvent être conservées grâce à l'utilisation de conditions de tampon moins rigoureuses et restent facilement identifiables. Ce protocole traite de l'étiquetage des cellules de culture de tissu avec des isotopes stables des acides aminés marqués, la transfection et l'immunoprécipitation d'une affinité marqué protéine d'intérêt, suivie de la préparation pour le dépôt d'une installation de spectrométrie de masse. Ce protocole traite ensuite comment analyser et interpréter les données renvoyées par le spectromètre de masse afin d'identifier les partenaires cellulaires interagissant avec une protéine d'intérêt. A titre d'exemple de cette technique est appliquée à identifier des protéines de liaison aux facteurs d'initiation de traduction eucaryotes: eIF4AI et eIF4AII.
Une étape essentielle dans la compréhension de la fonction des protéines est l'identification de protéines interagissant pertinentes. Lorsque ces protéines sont inconnues, il ya un certain nombre de techniques disponibles, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients. Il s'agit notamment du système de deux hybrides de levure, des essais déroulants utilisant la protéine recombinante, ainsi que la purification par affinité en tandem ou TAP-tagging 1, 2.
Une addition plus récente de ces techniques est la combinaison de la purification par affinité d'une protéine d'intérêt à partir d'une lignée cellulaire de mammifère approprié, suivie d'une spectrométrie de masse quantitative en utilisant un marquage isotopique stable d'acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) 3. Cela a des avantages sur la levure approche double-hybride en ce que la localisation cellulaire et les modifications post-traductionnelles sont pas perturbés, ainsi que des avantages plus traditionnelle TAP-tagging en ce qu'il s'agit d'une approche quantitative plutôt que qualitative permettant à l'utilisateur de readily distinguer non spécifiquement l'interaction des protéines et des contaminants, de facteurs de l'hôte qui se lient spécifiquement. En outre, comme un échantillon est généralement analysé ensemble, plutôt que de bandes de protéines individuels, des protéines d'intérêt ne sont pas masqués par la migration similaire des protéines sur un gel, pas plus qu'ils ne doivent généralement être présent à des concentrations suffisantes pour être visible après coloration, conduisant à augmentation du nombre de protéines identifiées confiance 4.
Pour illustrer cette technique, fusions GFP du facteur eucaryote d'initiation de traduction étroitement liée eIF4AI et eIF4AII qui part sur l'identité d'acides aminés de 90% ont été étudiés par la protéomique quantitative SILAC-immunoprécipitation. EIF4AI humain et II ont été clones dans pEGFP-C1 pour former une protéine de fusion où la GFP est fusionné à l'extrémité N-terminale de eIF4A. Pour éviter la nécessité de générer des lignées cellulaires stables transfection transitoire a été utilisé pour fournir ces constructions dans des cellules 293T en isotopes stables étiquetés.
Les cellules ont d'abord été marqué pendant deux semaines dans SILAC milieux de culture de cellules, suivie par la transfection d'ADN plasmidique codant pour une protéine d'intérêt. Les cellules ont ensuite été lysées, la concentration en protéines normalisées, et des quantités égales de lysat purifié par affinité sur agarose anti-GFP. Des quantités égales d'éluat sont ensuite combinés et soumis à une analyse LC-MS/MS. Les résultats de cette analyse sont ensuite traitées pour identifier les protéines de haute confiance: interactions de protéines (figure 1).
SILAC immunoprécipitation permet d'identifier non seulement les interactions directes, mais aussi faible affinité ou interactions indirectes avec des complexes de protéines 4. Grâce à ce système, eIF4AI et II immunoprécipitations permis l'identification reproductible et confiant du partenaire de liaison primaire eIF4G (isoformes I / II et III) 5, ainsi que les interactions indirectes avec eIF4E, et de nombreux composants du complexe eIF3.
1. Production et repiquage des lignées cellulaires de SILAC marqué
Remarque: l'utilisation de la trypsine-EDTA doit être évité à tous les stades de passages et la préparation des échantillons expérimentaux pour l'analyse comme la trypsine peut contenir des acides aminés non étiquetés, ce qui conduirait à l'étiquetage incomplet des échantillons.
2. Transfection de cellules marquées avec des constructions pEGFP-fusion
3. Récolte Lysats de cellules
4. Reliure à Anti-GPerles de PF
5. Laver, élution, et préparation des échantillons pour l'analyse MS
6 Analyse des données I:. Comprendre les résultats, et l'élimination des identifications faible confiance
Remarque: La liste des têtes de colonnes retournés par le logiciel du protéome Discoverer est donnée dans le tableau 1 Dif.logiciel de rentes (par exemple, MSQuant, MaxQuant) sera de retour différentes rubriques, cependant, seul un sous-ensemble de ceux-ci sont nécessaires pour l'analyse et ceux-ci sont communes aux différents logiciels. Les données doivent toujours inclure un numéro d'adhésion pour chaque protéine identifiée, le rapport de la comparaison de chaque rapport d'échantillonnage (lumière vs moyen, léger vs lourdes, moyennes vs lourde etc), le nombre de peptides uniques identifiés, et une certaine forme de taux de faux positifs ou d'une indication de confiance.
7 Analyse des données II:. Sélection Interactions élevés de confiance pour une étude plus approfondie
8 Analyse des données III:. Fusion de datasets Replica
Remarque: Pour être confiant dans l'identification de partenaires d'interaction d'une expérience déroulant SILAC typique devrait idéalement être effectué trois fois, avec le milieu et les échantillons étiquetés lourds commuté pour l'une des répétitions pour contrôler tout effet des médias sur les résultats. Une protéine qui se présente comme l'interaction d'au moins deux des trois expériences, avec le «échantillon switched'-médias représentant idéalement un d'eux, est une interaction de confiance élevé.
Dans une expérience SILAC déroulant typique, la grande majorité des protéines identifiées (> 90%) représentent des contaminants ainsi que des protéines de liaison non spécifique à la matrice d'affinité, ce qui est illustré sur la figure 2B, même si les protocoles de lavage de supprimer la majorité des contaminants cytoplasmiques tels que GAPDH (Figure 2A). Toutefois, la concentration des protéines de liaison non-spécifique en une distribution normale permet protéines qui se lient spécifiquement à une protéine d'intérêt doit être distinguée en tant que ceux-ci ont des ratios plus élevés échantillon / fictifs que l'arrière-plan. Alors que les contaminants devraient théoriquement se regrouper autour d'un rapport de 0 SILAC log 2, ce n'est pas nécessairement le cas, un exemple en est donné dans la figure 3. Raisons possibles pour cela inclure imparfait étiquetage SILAC de cellules, chargement volumes inégaux ou concentrations de lysat sur les perles anti-GFP, la perte accidentelle de perles pendant la purification ou inégal mélangetion d'échantillons à la fin de la procédure de purification 3. Toutefois, les données sont analysées en supposant fondée sur une norme seuil écart par rapport à la moyenne des contaminants normalement distribuées, des changements mineurs dans le centrage des données ne devraient pas affecter la qualité des résultats.
Lorsque l'on compare les différences dans les interactions protéiques entre les deux protéines apparentées, une situation similaire peut se produire où une protéine d'intérêt est produite à des niveaux plus élevés dans les cellules d'une seconde (soit en raison de la variation de l'efficacité de transfection, ou une propriété intrinsèque de la protéine ou de l'ARNm) . Une certaine variation dans l'expression (par exemple, figure 2A) peuvent être corrigées par l'analyse de la proportion de SILAC pour ces deux échantillons. Dans cet exemple, ce serait les échantillons GFP-eIF4AI et GFP-eIF4AII. En analysant le rapport 4AI/4AII SILAC comme indiqué à l'article 7, il est possible d'identifier les protéines dont la liaison varie considérablement entre les isoformes.
Sur la figure 4, une représentation des protéines de liaison à eIF4A identifiées dans l'une des répliques d'expériences réalisées est montré, illustrant la couverture du complexe du facteur d'initiation de ce protocole atteint. Les taux les plus élevés ont été généralement observées avec eIF4G, qui se lie directement à eIF4A, avec des ratios plus faibles pour eIF4E, qui se lie à eIF4G à un site en dehors du site de eIF4A contraignant. Ratios plus faibles ont été observés pour les membres du complexe eIF3. Cependant, cela illustre clairement que l'expérience satisfaisante identifié des partenaires de liaison à la fois directs et indirects de eIF4AI et II. Comme on pouvait s'y attendre de leur identité de séquence élevée 6, interactions protéine: protéine semblaient largement conservée entre les deux isoformes dans ce système expérimental 7, 8. Une sélection de certaines des protéines qui interagissent sont donnés dans le tableau 2, illustrant le format des données.Titre de la colonne | Description |
Accession | Affiche le numéro d'accès pour la séquence |
Couverture | Proportion de la séquence de la protéine couverte par les peptides identifiés |
♯ PSM | Peptide correspondance spectrale |
♯ peptides | Nombre total de peptides uniques identifiés pour une protéine |
♯ AA | La longueur d'une protéine dans les acides aminés |
MW (Da) | Le poids moléculaire d'une protéine dans Daltons. Exclut les modifications |
calc. PI | Le point isoélectrique théorique d'une protéine |
Score | Le score total d'une protéine (qui représente la somme de la indivscores peptidiques idual). Le score exact requis pour la signification varie selon les expériences. Une installation MS applique généralement un seuil de taux de fausse découverte de 5%. |
Séquence | La séquence des acides aminés constituant la protéine |
Rapport | L'intensité relative des peptides dans un échantillon marqué nommé, par rapport à un deuxième échantillon étiqueté |
Ratio comte | Le nombre de rapports de peptides qui ont été utilisés pour calculer le ratio de protéine donnée |
Ratio variabilité (%) | La variabilité des taux de peptides individuels utilisés pour calculer un rapport de la protéine donnée |
Description | Le nom de la protéine |
Tableau 1. Des rubriques standard d'un rapport du protéome Discoverer de colonne.Alors que des informations utiles peuvent être tirés de l'ensemble de ces colonnes, ceux qui critiquent pour cette analyse sont présentés en caractères gras.
Accession | Peptides | 4AI/Mock | 4AII/Mock | Nom | analyse de SILAC |
A8K7F6 | 21 | 100 | 1 | eIF4AI | Protéine «d'appât» |
Q14240 | 22 | 0,01 | 90,855 | eIF4AII | |
G5E9S1 | 25 | 47,575 | 30.53 | eIF4GI | Protéines interagissant |
Q59GJ0 | 5 | 11.778 | 10,619 | eIF4GII60; | |
P06730 | 3 | 7.22 | 7.57 | eIF4E | |
Q5T6W5 | 4 | 0,685 | 0,646 | hnRNPK | Contaminants non-liant spécifiquement |
P62805 | 1 | 0,531 | 0,498 | Histone H4 | |
H6VRG2 | 18 | - | - | Kératine-1 | Contaminants de l'environnement |
P35527 | 11 | 0,01 | 0,01 | Kératine 1 cytosquelette 9 |
Tableau 2. Données typiques d'une expérience SILAC d'immunoprécipitation. Donner des exemples de données pour une protéine d'intérêt / appât (haute peptides, ratio élevé), protéines interagissant avec une protéine d'intérêt (hautes et basses peptides /, ratio élevé), la liaison non spécifique protéines (haut-bas pept /ides, le ratio tombe en dessous de seuil - dans cette expérience 0.96), et les contaminants environnementaux (souvent des peptides élevés, le ratio négatif / en dessous du seuil).
Figure 1. Plan expérimental. Tout d'abord les cellules sont cultivées dans un milieu dépourvu d'arginine et de lysine et substitués par isotope stable marqué arginine et la lysine pendant 2 semaines (1). (2) Les cellules sont ensemencées dans 10 cm 2 plats et transitoirement transfectées avec des plasmides codant la GFP (Mock) ou des protéines de fusion GFP (échantillons). (3) Les cellules sont lysées et les protéines de fusion GFP ou GFP sont immunoprécipitées à partir de lysats cellulaires. (4) Les échantillons sont combinés dans un rapport de 1:1 et soumis à une analyse LC-MS/MS. Les données sont ensuite analysées pour enlever faible ident de la protéine de confiancefications et pour sélectionner un niveau d'enrichissement de protéine correspondant à des protéines interagissant authentiques.
Figure 2. Confirmation conditions d'immunoprécipitation appropriés. A) Analyse par transfert de Western des lysats cellulaires, ainsi que les fractions non liées et liées de l'immuno-précipitation et immuno-précipitation confirme l'expression de la protéine d'intérêt. Un Western blot contre GAPDH confirme épuisement des protéines non-interaction et un transfert de Western en outre un partenaire d'interaction connue du eIF4A confirme le succès de l'immunoprécipitation des protéines de liaison à la protéine d'intérêt. B) Comparaison partenaires d'interaction d'une protéine d'intérêt ne sont pas connus, un gel coloré à l'argent peut confirmer l'immunoprécipitation des protéines interagissantes. Sur cette argent-tache bandes de gel ed pour GFP et GFP-eIF4AI/II sont claires, et une bande migrant à la taille correcte pour eIF4G est présent seulement dans les voies GFP-4AI/II-bound et pas dans la voie de contrôle de la GFP.
Figure 3. Des résultats représentatifs. Histogramme montrant la répartition des taux de protéines d'une répétition de (A) GFP-eIF4AI ou (B) GFP-eIF4AII déroulant. La coupure de 1,96 écart-type est marqué par une ligne pointillée. Protéines interagissant relevant pas de contaminants normalement distribués sont évidents de ~ 0,25 et 1 (A), et ~ 0.3-1.5 en (B).
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Figure 4. Identification des membres complexes eIF partir d'une seule réplique d'une expérience SILAC IP. Protéines en vert étaient la protéine d'intérêt utilisé pour le menu déroulant Interaction protéines sont ombrées de rouge à blanc selon la log 2 ratio de SILAC dans l'IP SILAC rouge étant la protéine la plus abondante dans l'analyse, et le blanc étant le seuil d'écart-type de 1,96. Protéines en gris n'ont pas été identifiés dans cette analyse.
La stratégie déroulant SILAC décrit ici représente un moyen très sensibles et puissants de détection de nouvelle protéine: interactions entre protéines, et permet en outre la discrimination simple et rapide des modes de liaison entre les échantillons altérés étroitement liés d'intérêt. Dans cet exemple, cette technique a été utilisée pour étudier les interactions protéine: protéine des protéines eIF4AII eIF4AI et 6. À la connaissance de l'auteur, cette étude est la première dans la littérature exploiter l'utilitaire de protéomique de SILAC pour enquêter sur la interactome cellulaire de ces deux isoformes de eIF4A.
L'approche décrite ci-dessus utilise un GFP-tag et anti-GFP perles 9, 10 et donc des modifications peuvent être nécessaires pour permettre à cette approche doit être utilisé pour une protéine d'intérêt spécifique, par exemple si la balise est placée à l'extrémité N-ou C-terminale d'une protéine. Le cas échéant, des transferts Western possibles ou des tests fonctionnels devraientêtre effectuée pour détecter la liaison d'une protéine partenaire d'interaction connue. Si une protéine pas tolérer fusion avec une étiquette de la GFP, autre marquage ou stratégies déroulants ont été appliquées à pulldowns SILAC utilisant les deux autres balises (FLAG 11, biotine 12, STREP (données propres, non publié)), ou en utilisant des anticorps primaires contre une protéine d'où l'intérêt siRNA knockdown de la protéine cible fournit un échantillon de contrôle 13. Ces expériences ont été décrites ailleurs dans la littérature, mais en bref, l'étape 1 et les étapes 5.4-8 seraient appliquées comme ci-dessus, avec des étapes de 2 à 5,3 modifiés comme approprié pour le système d'expression / déroulant de choix en utilisant les entrées de protéines égalité comme décrit dans étapes 02.04 à 02.05. Comme les étapes de quantification permettent de protéines de liaison non spécifiques à être enlevés au niveau de l'analyse, il est recommandé d'omettre la pré-incubation avec des perles de contrôle, ou des lavages en sel élevées, afin de préserver la protéine de faible affinité: interactions de protéines avec une protéine d'intérêt . A ma nucléasey être inclus ou omis de ce protocole en fonction des spécificités d'une expérience particulière. Par exemple: que les protéines utilisées dans cette méthode sont hélicases d'ARN, RNase cocktail a été inclus dans le protocole pour éliminer les interactions indirectes médiées par l'ARN (étape 3.2). Dans certains cas toutefois, il pourrait être avantageux d'exécuter des expériences parallèles avec et sans nucléase pour identifier les interactions dépendantes d'acide nucléique.
Dans ce protocole, la commutation de «moyen» et échantillons «lourds» dans les expériences répétées est recommandé de contrôler les variations introduites par des différences dans les médias de SILAC ou la croissance des cellules. Un contrôle alternative implique la commutation séquentielle des trois (, 'moyen' «lumière», et «lourd») médias dans des répliques expériences. Tandis que cette approche est potentiellement plus strictes, il n'augmente la complexité de l'analyse, comme dans au moins une répétition, une protéine d'intérêt wmal être produite dans des cellules «légères» étiquetés et il est donc nécessaire de faire la distinction entre les protéines systématiquement identifiées dans les échantillons «légers» (contaminants environnementaux tels que les kératines), et ceux qui ne sont enrichies dans les échantillons «légers» quand il est lié à une protéine de intérêt.
Alors que l'utilisation des données de quantification permet de discrimination spécifique des interactions non-spécifiques grâce à l'utilisation d'un seuil, inévitablement des interactions authentiques peut être jeté. L'approche ci-dessus est une approche simple et rapide pour l'identification des interactions protéine: protéine qui peut être facilement tenté par des chercheurs qui n'ont aucune expérience précédente avec la spectrométrie de masse, ou l'analyse de grande protéine: protéine ensembles de données d'interaction. Pour la plupart des utilisations ce qui est plus que suffisant pour identifier de nouvelles protéines d'intérêt. D'autres modifications à cette approche pour aider à réduire cette perte de données sont décrits ailleurs dans la littérature et comprennent l'utilisation d'un prbibliothèque de fréquence où otein protéines contaminantes connu pour un ensemble spécifique de paramètres expérimentaux (lignée de cellules, la matrice de billes, des conditions de tampon) peut être exclu 10, 14. Toutefois, en fonction des paramètres expérimentaux particuliers, il peut être nécessaire d'exécuter un certain nombre d'expériences de contrôle pour générer un protéome de talon, ce qui peut donc augmenter à la fois le coût et la complexité de l'expérience. De plus amples informations sur cette technique est disponible sur le site de www.peptracker.co.uk 14.
Il convient également de noter que le protocole décrit ci-dessus consiste à mélanger des échantillons différemment marqués à la fin du processus d'immunoprécipitation (appelé un mélange Après purification - expérience de SILAC MAP). Ceci est fait comme interactions protéine: protéine se produisent à un équilibre donné 15. Il convient de noter que d'autres groupes ont combiné cette approche MAP SILAC décrite dans ce protocole avec incubation des échantillonsavant pulldown (Purification Après Mélange - SILAC PAM) pour différentes longueurs de temps (20 min à 2 h ont été utilisés dans la littérature) 15, 16. Sur la base de la rapidité avec laquelle un taux de protéine gouttes vers 01h01, il est possible d'étudier qualitativement et affinités de liaison pour définir des protéines comme les protéines qui interagissent stables ou dynamiques 15.
En résumé, pulldowns SILAC représentent un moyen très puissant pour identifier les protéines qui interagissent avec une protéine d'intérêt donné, dans un cadre physiologiquement pertinents. La technique peut être très facilement adapté à un certain nombre de stratégies de purification, ce qui permet son application à une protéine d'intérêt donné. La quantification des résultats simplifie grandement l'identification des interactions authentiques, et permet la détente de strictes conditions de tampon utilisés pour éliminer les liants non-spécifiques, et préserve ainsi les interactions de faible affinité. Comme jusqu'à trois échantillons peuvent être comparés en ce qui précèdestratégie, la technique a des atouts à comparer les différences claires dans la protéine de liaison entre les différentes isoformes de protéines, les protéines mutantes, ou l'effet des inhibiteurs pharmacologiques. Comme tranches de gel entiers sont analysés plutôt que des bandes individuelles que tache par Coomassie, le nombre de protéines identifiées au niveau de confiance élevé sont généralement plus élevés que ceux identifiés dans un TPS / TAP-déroulant standard, et expérimentateur biais dans la sélection des protéines d'intérêt est retiré. La technique compare donc très favorablement à d'autres techniques couramment utilisés dans l'identification de nouvelles protéines-interactions (levure 2-hybrides, la TPS / Son ou TAP Pulldowns).
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Ce travail a été soutenu par des subventions du Wellcome Trust et le BBSRC à IG. IG est un Wellcome Senior Fellow.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10 kDa cutoff) 500 ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25 g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25 g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock) |
Penicillin/streptomycin, Liquid. 100 ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500 μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7 ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1 L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |
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