Murine Transplantation de peau pleine épaisseur

Résumé

Murine transplantation pleine épaisseur peau est un modèle bien établi pour étudier le rejet dans un cadre de allo. Ici, nous vous proposons un tutoriel de chaque étape impliquée dans la réalisation d'une / c BALB -> C57BL / 6 de pleine épaisseur greffe de peau.

Résumé

Murine transplantation pleine épaisseur peau est un modèle in vivo bien établi pour étudier la réponse allo et le rejet de greffe. En dépit de son application limitée à l'homme, la transplantation de la peau chez la souris a été largement utilisé pour la recherche sur la transplantation. La procédure est facile à apprendre et à exécuter, et il ne nécessite pas de techniques de microchirurgie délicates, ni une formation approfondie. De plus, le rejet de greffe dans ce modèle se produit dans une réaction immunologique très reproductible et est aisément contrôlée par inspection directe et palpation. En outre, la transplantation de la peau secondaire avec des greffes de donneurs appariés ou de la peau par des tiers peut être effectuée sur des modèles plus complexes de transplantation comme une méthode alternative et simple pour évaluer la tolérance spécifique du donneur. Les complications sont faibles et sont en général limités à une surdose d'anesthésie ou de détresse respiratoire après la procédure. échec de la greffe, d'autre part, se produit fréquemment par suite d'une mauvaise préparation du grà l'arrière, un mauvais positionnement dans le lit de greffe, ou un emplacement inapproprié de la bande. Dans cet article, nous présentons un protocole de pleine épaisseur transplantation de la peau chez la souris et de décrire les étapes importantes nécessaires à une procédure réussie.

Introduction

La transplantation d'organes est le traitement de choix pour les patients souffrant d'insuffisance d'organes en phase terminale, et les résultats se sont améliorés remarquablement avec les progrès des interventions chirurgicales et des protocoles d'immunosuppression. Cependant, immunosuppression à long terme est associée à des effets secondaires importants, et le développement de nouvelles stratégies qui promeuvent la tolérance demeure l'objectif de la recherche en transplantation moderne.

De nombreux modèles animaux ont été développés pour la recherche fondamentale en transplantation, pour étudier les mécanismes de rejet d'allogreffe et de tester immunosuppression approches pour prévenir le rejet de greffe et pour la promotion de la tolérance à long terme ^1-3. Des modèles de souris sont devenus le pilier de la recherche immunologique due à la disponibilité exclusive et vaste d'anticorps diagnostiques et thérapeutiques et les souches consanguines et transgéniques bien définies. la transplantation de la peau est une procédure simple qui ne nécessite pas de compétences particulières de microchirurgie et peutêtre facilement contrôlé postopératoires. Pris ensemble, la transplantation de la peau de la souris a été un outil exceptionnel pour étudier de nombreux aspects impliqués dans la réponse allo, y compris la livraison de l' antigène, le trafic cellulaire, et la destruction des tissus pendant le rejet de greffe ^4,5.

Ici, nous montrons la procédure étape par étape pour la transplantation de la peau de pleine épaisseur en utilisant le modèle de la souris, et nous décrivons les étapes importantes nécessaires pour une prise de greffe réussie de la peau transplantée.

Protocole

Toutes les procédures ont été menées en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Institut national de la santé (NIH) et ont été approuvés par le Comité de l'Université Johns Hopkins et l'utilisation des soins aux animaux (JHUACUC). Les procédures spécifiques ont été réalisées dans le cadre du protocole ACUC approuvé MO13M292 et MO13M370.

Récolte de la peau 1. Donateur

1. Anesthésier la souris donneuse avec de l'isoflurane (induction vaporiseur à 4%, la maintenance à 1 - 2% à travers le cône de la souris). Utilisez l'orteil retrait de pincement réflexe pour contrôler la profondeur de l'anesthésie.
2. L' utilisation d' un rasoir électrique, de se raser le dos de l'animal et la désinfecter avec 10% de povidone iode (par exemple, Betadine).
3. Avec des ciseaux stériles, des gants et une technique aseptique, récolte donneur peau du dos de la hanche au cou, avec dissection au niveau du tissu conjonctif aréolaire.
4. Euthanasier l'animal par dislocation cervicale après la récolte desgreffe de peau.
5. Sous un microscope, séparer le tissu conjonctif, le tissu adipeux, et pannicule carnosus de la peau du dos en utilisant des ciseaux fins de ténotomie. Le carnosus pannicule est une mince musculaire transparente responsable des mouvements saccadés de la peau.
6. En utilisant la technique des instruments stériles, découper 15 mm x 15 mm greffes de la peau du dos pour un 10 mm x 10 mm à 15 mm lit de greffe x 15 mm.
7. Stocker les greffes sur des gazes imbibées avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) dans une boîte de Pétri sur de la glace.
   NOTE: 8 - 10 greffes peuvent être obtenues à partir d'une souris donneuse.

Transplant de la peau 2. Destinataire

1. Anesthésier la souris receveuse avec isoflurane (induction vaporiseur à 4%, la maintenance à 1 - 2% à travers le cône de la souris). Utilisez l'orteil retrait de pincement réflexe pour contrôler la profondeur de l'anesthésie.
2. Administrer 0,02 mg / kg de poids corporel de la buprénorphine pour le soulagement de la douleur postopératoire.
3. Rasez le côté du dos de l'animal, où la greffe will être inséré et désinfecter avec 10% de povidone iode.
4. Avec des ciseaux, couper 10 mm x 10 mm à 15 mm x 15 mm carré de peau. La taille du défaut devrait être légèrement plus grande (10%) que le greffon. Coupez aussi superficiellement que possible. Prenez soin de préserver la carnosus pannicule et les vaisseaux. Le panniculus carnosus peut être distinguée de la planche de bord sous-jacent, par sa mobilité et les vaisseaux sanguins superficiels qui courent à lui.
5. Positionner le greffon sur le lit de greffe, ce qui évite des plis le long des bords.
6. Placez 8 sutures sur les coins et sur le milieu de chaque bord. Pour chaque suture, passer l'aiguille à travers le greffon et ensuite à travers l'carnosus pannicule du greffon lit sous la peau bénéficiaire environnante.
7. Retirer le masque d'anesthésie et de laisser l'animal récupérer partiellement de l'anesthésie avant d'appliquer le pansement adhésif.
8. Envelopper la souris receveuse dans un pansement adhésif avec de la gaze repliée sur la greffe. Faire le bandage en combinant deux bandages, coupela partie adhésive de l'une et de placer les deux tampons absorbants ensemble.
9. Surveiller la souris lors de la récupération de près pour assurer que le bandage ne limite pas le thorax excursion et de respirer. Retirez le bandage si la fréquence respiratoire diminue ou l'animal commence à haleter ou souffle faiblement.

3. Soins postopératoires

1. Administrer enrofloxacine 5 mg / kg après une intervention chirurgicale pour la prophylaxie de l'infection.
2. Placez la souris transplantées dans une cage propre sur un coussin chauffant au micro-ondes jusqu'à ce qu'il récupère complètement de l'anesthésie.
3. Observez la souris pendant 1 h après l'opération avant de le retourner à l'installation de logements.
4. Sept jours après la chirurgie, anesthésier la souris comme dans l'étape 2.1. Retirez le bandage en coupant seulement par la face ventrale du bandage.
5. Observer et palper la greffe le jour suivant pour des signes de scabbing, la contraction ou la dureté. Si elle est présente, la greffe peut ne pas avoir atteint vasculariza bontion et devrait être considérée comme une défaillance technique.
6. Surveillez quotidiennement les signes de rejet. Prendre en considération les greffes rejetée lorsque ≥90% du tissu greffé devient nécrotique.
7. Euthanasier les animaux rejetés et les récolter pour l'analyse.

Résultats

Le placement du bandage sur la souris receveuse est une étape importante de la procédure. La greffe de peau est positionné sur le tronc du destinataire, entre l'épaule, la hanche et la colonne vertébrale (Figure 1). Le bandage est réalisée avec de la gaze pliée et la combinaison de deux bandes adhésives en plastique. La souris receveuse est placé avec le greffon vers le bas au-dessus de la toile métallique sur le centre de la bande. L'utilisation de de...

Discussion

Depuis son introduction par Medawar, d' abord dans des études humaines, puis chez les lapins et les souris, la transplantation de la peau a été un modèle précieux pour l'étude des réponses immunitaires allogéniques ^6,7. Dans ce manuscrit, nous présentons un modèle de grande échelle, non-vascularisées, la transplantation de peau totale en utilisant la peau supérieure et inférieure du dos. Diverses méthodes alternatives, y compris en utilisant la peau de la queue ou la peau de l' orei...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight micro forceps	Sigma	F4017
Curved micro forceps	Aesculap	BD333R
Curved Stevens tenotomy scissors	Aesculap	BC905R
Mayo dissecting scissors	Sigma	S3146
Micro needle holder	Aesculap	BM563R
Sterile gauze	Covidien	441218
6-0 Nylon suture	MWI	31849
Plastic Strips Band-Aid	Johnson & Johnson		Obtained from pharmacy
10 cm Petri dish	Fisherbrand	FB0875712
PBS	Quality Biological	119069131
Buprenorphine			DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy
Enrofloxacin	Bayer Health Care	186599