Murine tutto spessore trapianto della pelle

Riepilogo

Murino di trapianto a tutto spessore della pelle è un modello consolidato per studiare il rifiuto in un ambiente alloimmune. Qui, mettiamo a disposizione un tutorial di ogni passo coinvolti in esecuzione di un BALB / c -> C57BL / 6 a tutto spessore trapianto di pelle.

Abstract

Murino di trapianto a tutto spessore della pelle è un modello in vivo consolidata per studiare alloimmune risposta e rigetto del trapianto. Nonostante la sua limitata applicazione per gli esseri umani, il trapianto di pelle nei topi è stato ampiamente impiegato per la ricerca sui trapianti. La procedura è facile da imparare ed eseguire, e non richiede tecniche microchirurgiche delicate né una formazione completa. Inoltre, il rigetto in questo modello si verifica in una reazione immunologica molto riproducibili ed è facilmente monitorato mediante ispezione diretta e palpazione. Inoltre, il trapianto di pelle secondario con innesti donatore corrispondenza o pelle di terze parti può essere eseguita su più modelli di trapianto complessi come un metodo alternativo e semplice per valutare la tolleranza specifici per donatore. Le complicazioni sono bassi e sono in genere limitati a overdose anestesia o distress respiratorio dopo la procedura. fallimento Graft, invece, si verifica comunemente come a causa della scarsa preparazione del gra poppa, errato posizionamento nel letto trapianto, o il posizionamento inadeguato del bendaggio. In questo articolo, vi presentiamo un protocollo per il trapianto di pelle a tutto spessore nei topi e descrivere i passi importanti necessari per una procedura di successo.

Introduzione

Il trapianto di organi è il trattamento di scelta per i pazienti con insufficienza terminale d'organo, ed i risultati hanno migliorato notevolmente con i progressi nelle procedure chirurgiche e protocolli immunosoppressione. Tuttavia, immunosoppressione a lungo termine è associato ad effetti collaterali significativi, e lo sviluppo di nuove strategie che promuovano la tolleranza rimane l'obiettivo della ricerca trapianti moderna.

Numerosi modelli animali sono stati sviluppati per la ricerca di base nel trapianto, per studiare i meccanismi di rigetto e per testare immunosoppressione approcci per prevenire il rigetto del trapianto e per promuovere la tolleranza a lungo termine ^1-3. modelli di topo sono diventati il ​​cardine della ricerca immunologica grazie alla disponibilità esclusiva e vasta di anticorpi diagnostici e terapeutici e ceppi inbred e transgenici ben definiti. Il trapianto della pelle è una procedura semplice che non richiede particolari competenze di microchirurgia e puòessere facilmente monitorati dopo l'intervento. Nel loro insieme, il trapianto di pelle del mouse è stato uno strumento eccezionale per studiare molti aspetti coinvolti nella risposta alloimmune, tra cui la consegna antigene, il traffico delle cellule, e la distruzione dei tessuti durante rigetto del trapianto ^4,5.

Qui, vi mostriamo la procedura passo-passo per il trapianto a tutto spessore della pelle utilizzando il modello di topo, e descriviamo i passi importanti necessari per un attecchimento di successo della pelle trapiantata.

Protocollo

Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institute of Health (NIH) e sono stati approvati dal Comitato Johns Hopkins University Animal Care e Usa (JHUACUC). Le procedure specifiche sono state eseguite sotto la protocolli ACUC approvato MO13M292 e MO13M370.

1. donatore Harvest pelle

1. Anestetizzare il mouse donatore con isoflurano (vaporizzatore induzione a 4%, manutenzione a 1 - 2% attraverso il cono del mouse). Utilizzare la punta pizzico di ritiro reflex per monitorare la profondità dell'anestesia.
2. Usando un rasoio elettrico, radere dorso dell'animale e disinfettare con 10% di iodio povidone (ad esempio, Betadine).
3. Utilizzando forbici sterili, guanti e tecnica asettica, pelle di nuovo raccolto donatore dal fianco al collo, con scollamento a livello del tessuto connettivo areolare.
4. Eutanasia dell'animale da dislocazione cervicale dopo la raccolta delinnesto di pelle.
5. Sotto un microscopio, separare il tessuto connettivo, tessuto adiposo, e pannicolo carnosus dalla pelle indietro con le forbici tenotomy sottili. Il carnosus pannicolo è un sottile, trasparente muscoli responsabili dei movimenti contrazioni della pelle.
6. Usando una tecnica strumenti sterili, tagliare innesti 15 mm x 15 mm dalla pelle indietro per un 10 mm x 10 mm per 15 mm letto trapianto x 15 mm.
7. Conservare gli innesti su garze imbevute con sterile tampone fosfato salino (PBS) in una capsula di Petri sul ghiaccio.
   NOTA: 8 - 10 innesti può essere ottenuta da un topo donatore.

2. trapianto di pelle

1. Anestetizzare il mouse destinatario con isoflurano (vaporizzatore induzione a 4%, manutenzione a 1 - 2% attraverso il cono del mouse). Utilizzare la punta pizzico di ritiro reflex per monitorare la profondità dell'anestesia.
2. Somministrare 0,02 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per alleviare il dolore post-operatorio.
3. Shave lato del dorso dell'animale in cui l'innesto will essere inserito e disinfettare con il 10% di iodio povidone.
4. Utilizzando le forbici, tagliare un 10 mm x 10 mm per 15 mm x 15 mm quadrato di pelle. La dimensione difetti dovrebbe essere leggermente più grande (10%) rispetto al trapianto. Tagliare come superficialmente possibile. Fare attenzione a preservare la carnosus pannicolo e vasi. La carnosus pannicolo può essere distinto dal fascia sottostante per la sua mobilità e dei vasi sanguigni che corrono superficiale ad esso.
5. Posizionare l'innesto sul letto graft, evitando pieghe lungo i bordi.
6. Mettere 8 punti di sutura sugli angoli e sul centro di ciascun bordo. Per ciascuna di sutura, passare l'ago attraverso l'innesto e poi attraverso la carnosus pannicolo dell'innesto letto sotto la pelle del destinatario circostante.
7. Rimuovere la maschera anestetico e lasciare che l'animale recupera parzialmente da anestesia prima di applicare il cerotto.
8. Avvolgere il mouse destinatario in un bendaggio adesivo con garza piegata sopra l'innesto. Effettuare la benda dalla combinazione di due bende, tagliola parte adesiva di uno e posizionare i due tamponi assorbenti insieme.
9. Monitorare il mouse da vicino durante il recupero per garantire che il bendaggio non sta limitando torace escursione e la respirazione. Togliere la benda se la frequenza respiratoria diminuisce o l'animale comincia a boccheggiare o alito superficialmente.

3. Cura postoperatoria

1. Somministrare enrofloxacina 5 mg / kg dopo l'intervento chirurgico per la profilassi delle infezioni.
2. Posizionare il mouse trapiantato in una gabbia pulita su una piastra elettrica per microonde fino a quando non recupera completamente dall'anestesia.
3. Osservare il mouse per 1 ora dopo l'intervento prima di ritornare alla struttura alloggiativa.
4. Sette giorni dopo l'intervento, anestetizzare il mouse come al punto 2.1. Rimuovere il bendaggio tagliando solo attraverso il lato ventrale della benda.
5. Osservare e palpare il trapianto il giorno successivo per i segni di formazione di croste, la contrazione, o la durezza. Se presente, l'innesto può non aver raggiunto la corretta vascularizazione e deve essere considerato un guasto tecnico.
6. Daily Monitor per i segni di rigetto. Considerare innesti respinto quando ≥90% del tessuto trapianto diventa necrotico.
7. Eutanasia gli animali rifiutati e li raccolto per l'analisi.

Risultati

Il posizionamento del bendaggio sul mouse destinatario è un importante passo della procedura. L'innesto di pelle è posizionato sul tronco destinatario, tra la spalla, anca e colonna vertebrale (Figura 1). La benda è realizzata con garza piegata e la combinazione di due bende adesive plastica. Il mouse destinatario è posizionato con l'innesto giù sopra la garza sul centro della benda. Utilizzando due micro pinze curve, l'estremità inferiore della benda ?...

Discussione

Dalla sua introduzione da Medawar, prima in studi sull'uomo e poi nei conigli e topi, il trapianto di pelle è stato un modello prezioso per lo studio delle risposte immunitarie allogeniche ^6,7. In questo manoscritto, vi presentiamo un modello di grandi dimensioni, non vascolarizzato, il trapianto a tutto spessore della pelle con la pelle posteriore superiore e inferiore. Vari metodi alternativi, tra cui l'uso della pelle coda o la pelle dell'orecchio del mouse come fonte innesto di tessuto, sono ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight micro forceps	Sigma	F4017
Curved micro forceps	Aesculap	BD333R
Curved Stevens tenotomy scissors	Aesculap	BC905R
Mayo dissecting  scissors	Sigma	S3146
Micro needle holder	Aesculap	BM563R
Sterile gauze	Covidien	441218
6-0 Nylon suture	MWI	31849
Plastic Strips Band-Aid	Johnson & Johnson		Obtained from pharmacy
10 cm Petri dish	Fisherbrand	FB0875712
PBS	Quality Biological	119069131
Buprenorphine			DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy
Enrofloxacin	Bayer Health Care	186599