Longitudinale morphologiques et physiologiques surveillance des sphéroïdes de tumeur en trois dimensions à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Résumé

Tomographie par cohérence optique (OCT), une technologie d’imagerie en trois dimensions, a été utilisé pour surveiller et caractériser la cinétique de croissance des sphéroïdes multicellulaires de tumeur. Une quantification volumétrique précise des sphéroïdes de tumeur à l’aide d’un voxel comptage approche et la détection de tissu mort exempte d’étiquette dans les sphéroïdes basé sur contraste intrinsèque d’atténuation optique, ont été démontrées.

Résumé

Sphéroïdes de tumeur ont été développées comme un modèle de culture en trois dimensions (3D) cellule en découverte de médicaments contre le cancer et de recherche de cancer. Cependant, actuellement, haut-débit, modalités d’imagerie utilisant la détection de champ ou de la fluorescence lumineuse, sont incapables de résoudre la structure 3D dans l’ensemble de l’ellipsoïde de la tumeur en raison de la pénétration de la lumière limitée, diffusion des colorants fluorescents et profondeur-être. Récemment, notre laboratoire a démontré l’utilisation de la tomographie par cohérence optique (OCT), un sans étiquette et non destructifs en 3D imagerie modalité, pour effectuer la caractérisation longitudinale des sphéroïdes multicellulaires tumeur dans une plaque à 96 puits. OCT a été capable d’obtenir des informations morphologiques et physiologiques 3D des sphéroïdes de tumeur de plus en plus jusqu'à environ 600 µm de hauteur. Dans cet article, nous démontrons un système d’imagerie de OCT (HT-OCT) haut débit qui balaye la plaque multipuite ensemble et obtient automatiquement les données 3D de OCT des sphéroïdes de tumeur. Les auteurs décrivent les détails des HT-OCT système et construction établies dans le protocole. Partir des données 3D de OCT, on peut visualiser la structure globale de l’ellipsoïde avec 3D rendu et tranches orthogonaux, caractériser la courbe de croissance longitudinale de l’ellipsoïde de tumeur basée sur l’information morphologique de la taille et le volume et surveiller la croissance des les régions de cellules mortes dans la sphéroïde de tumeur basé sur contraste optique atténuation intrinsèque. Nous montrons que HT-OCT est utilisable comme une modalité d’imagerie haut débit pour médicament dépistage mais aussi caractériser biofabricated échantillons.

Introduction

Le cancer est la deuxième cause de décès dans le monde¹. Développement de médicaments ciblant le cancer est d’une importance cruciale pour les patients. Toutefois, on estime que plus de 90 % des nouveaux médicaments anticancéreux échouent dans la phase de développement en raison du manque d’efficacité et de toxicité imprévue dans les essais cliniques². Une partie de la raison peut être attribuée à l’utilisation de modèles de culture cellulaire (2D) deux dimensions simples d’inspection/filtrage composé qui fournissent des résultats avec des valeurs prédictives limités composée efficacité et la toxicité pour les étapes sui

Protocole

1. préparation des cellules

1. Obtenir des lignées cellulaires d’un fournisseur qualifié.
   Remarque : Vérifiez que les cellules des lignées de cellules d’intérêt peuvent former sphéroïde dans les milieux de culture ou à l’aide d’un substrat (membrane basale matrice comme Matrigel). Regarder dans la littérature⁹ ou effectuer une ronde d’une expérience préalable pour une vérification.
2. Décongeler les cellules congelées suivant la procédure spécifique prévue par le fournisseur de la lignée cellulaire. Une procédure générale peut être trouvée ailleurs⁴³.
3. La culture des cellules pour 1 à 2 passages

Résultats

Haut débit Optical Coherence Tomography imagerie des sphéroïdes dans une plaque à 96 puits

La figure 3 présente la suite de l’analyse de HT-OCT d’une plaque 96 puits à sphéroïde tumeur HCT 116 le jour 3. L’analyse séquentielle d’une plaque entière commence à partir du puits de bas-droite (H12). Figure 3 b montre l’organigramme de l’implémentation du...

Discussion

Activité antitumorale est très importante pour sa structure morphologique. Semblable à la courbe de croissance caractéristique pour cultures cellulaires 2D de surveillance, suivi de la courbe de croissance pour les sphéroïdes tumeur 3D est également une approche conventionnelle de caractériser le comportement de la croissance à long terme sphéroïde pour différentes lignées cellulaires. En particulier, nous pouvons caractériser la réaction aux médicaments en analysant la dégradation de la tumeur ou tumeur...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Custom Spectral Domain OCT imaging system			Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD)	Thorlabs	SLD1325	light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio	AC Photonics	WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube	Thorlabs
Adapter	Thorlabs
Collimating Lens	Thorlabs	AC080-020-C
Focusing Lens	Thorlabs
Kinematic Mirror Mount	Thorlabs
Mirror	Thorlabs
1D Translational Stage	Thorlabs
Continuous neutral density filter	Thorlabs
Pedestrial Post	Thorlabs
Clamping Fork	Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube	Thorlabs
Adapter	Thorlabs
Collimating Lens	Thorlabs	AC080-020-C
Galvanometer	Thorlabs
Relay Lens	Thorlabs	AC254-100-C	two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount	Thorlabs
Mirror	Thorlabs
Objective	Mitutoyo
Pedestrial Post	Thorlabs
Clamping Fork	Thorlabs
Polarization Controller	Thorlabs
30mm Cage Mount	Thorlabs
Cage Rod	Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder			3D printed
Spectrometer
Lens Tube	Thorlabs
Adapter	Thorlabs
Collimating Lens	Thorlabs	AC080-020-C
Grating	Wasatch		G = 1145 lpmm
F-theta Lens	Thorlabs	FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera	Sensor Unlimited	SU1024-LDH2
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line	ATCC	CCL-247
Cell Culture Flask	SPL Life Sciences	70025
Pipette	Fisherbrand	14388100
Pipette tips	Sorenson Bioscience	10340
Gibco GlutaMax DMEM	Thermo Fisher Scientific	10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin	Thermo Fisher Scientific	16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate	Corning	7007
Gibco PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators	Thermo Fisher Scientific	3120
Gloves	VWR	89428-750
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Transfer pipets	Globe Scientific	138080
Centrifuge	Eppendorf	5702 R	To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge	NUAIRE	AWEL CF 48-R	To centrifuge the 96-well plate
Microscope	Olympus
Name	Company	Catalog Number	Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner	Leica	Aperio AT2	Obtain high-resolution histological images
Histology Service	Histowiz		Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name	Company	Catalog Number	Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system	Thorlabs	Telesto Series
SD-OCT system	Wasatch Photonics	WP OCT 1300 nm
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis	NIH	ImageJ	Fiji also works.
3D Rendering	Thermo Fisher Scientific	Amira	Commercial software. Option 1
3D Rendering	Bitplane	Imaris	Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software			custom developed in C++.
Stage Control	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	MRC_3	Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software			custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis			custom developed in MATLAB