Méthylation Spécifique Multiplex Droplet PCR à l’aide de polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Résumé

Les marqueurs épigénétiques sont utilisés pour le sous-tétrage des globules blancs (WBC) par la quantification des modèles de méthylation de l’ADN. Ce protocole présente une méthode de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette multiplexe (mdPCR) utilisant un dispositif microfluidique thermoplastique d’élastomère (TPE) pour la génération de gouttelettes permettant une quantification cible précise et multiplexe spécifique à la méthylation des nombres différentiels WBC.

Résumé

Un flux de travail de PCR de gouttelette multiplexe (mdPCR) et un protocole détaillé pour déterminer le nombre différentiel de globules blancs épigénétiques (WBC) sont décrits, ainsi qu’un dispositif thermoplastique de génération de gouttelettes d’élastomère (TPE). Les marqueurs épigénétiques sont utilisés pour le sous-typage WBC qui est d’une valeur pronostique importante dans différentes maladies. Ceci est réalisé par la quantification des modèles de méthylation de l’ADN de régions spécifiques riches en CG dans le génome (CpG loci). Dans cet article, l’ADN traité en bisulfite provenant de cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) est encapsulé dans des gouttelettes avec des réactifs mdPCR, y compris des amorces et des sondes fluorescentes d’hydrolyse spécifiques aux loci cpg qui sont en corrélation avec les sous-populations WBC. L’approche multiplexe permet l’interrogatoire de nombreux loci CpG sans avoir besoin de réactions mdPCR séparées, permettant une détermination paramétrique plus précise des sous-populations WBC à l’aide de l’analyse épigénétique des sites de méthylation. Cette quantification précise peut être étendue à différentes applications et met en évidence les avantages pour le diagnostic clinique et le pronostic suivant.

Introduction

L’analyse de la composition des globules blancs (CWB) est l’un des tests de laboratoire les plus fréquemment demandés dans le diagnostic hématologique. Le nombre différentiel de leucocytes sert d’indicateur pour un spectre de maladies comprenant l’infection, l’inflammation, l’anémie, et la leucémie, et est sous l’étude en tant que biomarqueur pronostique tôt pour plusieurs autres conditions aussi bien. L’étalon-or dans le sous-typage WBC implique l’immunostaining et/ou la cytométrie de flux qui exigent des anticorps fluorescents coûteux et sujets à l’instabilité et sont souvent fortement dépendants de la compétence de l’opérateur dans la préparation de l’échantillon. En outre, cette méthode ne s’applique qu’aux échantillons de sang frais, de sorte que les échantillons ne peuvent pas être congelés pour l’expédition ou l’analyse ultérieure.

Les marqueurs épigénétiques ont récemment émergé comme de puissants outils d’analyse pour l’étude des variations phénotypiques. Par la suite, il a été démontré que les populations de leucocytes humains avaient des modèles de méthylation de l’ADN de lignée cellulaire qui permettent la caractérisation précise des sous-ensembles WBC. Le sous-texte basé sur des marqueurs épigénétiques offre une alternative prometteuse qui ne dépend pas de la collecte d’échantillons de sang frais ou d’anticorps coûteux et peut être exploité comme biomarqueur pour l’apparition de la maladie et la susceptibilité^1,2,3,4,5.

Des études à l’échelle du génome ont été réalisées pour une cartographie approfondie des régions spécifiques méthylées riches en CG dans le génome (îles CpG) dans des sous-types de leucocytes afin d’identifier les marqueurs épigénétiques candidats spécifiques aux sous-types de leucocytes. Des protocoles PCR ont été développés en raison de cette raison pour les régions de gènes méthylés, par exemple, CD3Z et FOXP3, correspondant à CD3⁺ T-Cells et CD4⁺ CD25⁺ T-Cells régulateurs (T-Regs), respectivement. Wiencke et coll. ont démontré l’utilité de la gouttelette duplex PCR pour le sous-typage épigénétique des lymphocytes T, donnant des résultats qui sont fortement corrélés avec l’analyse de tri cellulaire activée par flux (FACS)⁶. Cette méthode d’analyse génétique quantitative repose sur la partition des molécules d’acide nucléique de modèle et des réactifs PCR en milliers de gouttelettes discrètes, définies de façon volumétrique et sous-nanolitres contenant zéro, une ou plusieurs copies d’acide nucléique cible, à l’aide d’émulsions d’eau dans l’huile activées par microfluidiques^7,8. L’amplification du PCR est effectuée dans chaque gouttelette individuelle et l’intensité de fluorescence du point d’évaluation de chaque gouttelette est mesurée, ce qui permet une quantification absolue des cibles présentes dans l’échantillon. Droplet PCR a été établi pour être plus précis, précis, et techniquement plus simple que qPCR standard, ce qui en fait une méthode plus favorable à base de méthylation de l’ADN pour l’évaluation clinique des lymphocytes T. Bien qu’une méthodologie de sous-tage émerge rapidement, l’analyse épigénétique multiplexée pour sonder pour diverses régions méthylées de CpG manque simultanément. Ceci est nécessaire pour les comptes différentiels de leucocytes de routine.

Ici, un dispositif microfluidique de gouttelette thermoplastique d’élastomère (TPE) est présenté et employé pour la mélilation spécifique à la gouttelette multiplexe PCR (mdPCR). La technologie a été utilisée pour délimiter des sous-types spécifiques de leucocytes, CD3⁺ T-Cells et CD4⁺ CD25⁺ T-Regs, basés sur des modèles de méthylation de l’ADN de lignée cellulaire, c’est-à-dire la variation épigénétique des régions CD3Z et FOXP3 CpG, respectivement. Un protocole détaillé pour l’extraction de l’ADN, la conversion de bisulfite et le mdPCR est décrit de concert avec une méthode de fabrication pour un dispositif de génération de gouttelettes de TPE. Les résultats représentatifs de la méthode sont comparés à ceux de la coloration d’immunofluorescence soulignant l’utilité de l’approche proposée.

Protocole

Toutes les expériences réalisées dans le domaine de cette étude portant sur des échantillons humains ont été approuvées par le Comité d’éthique du CNRC et ont été réalisées conformément aux politiques du CNRC régissant les sujets humains qui suivent les lignes directrices de recherche applicables et qui sont conformes aux lois du Québec, au Canada.

1. Préparation cellulaire

1. Décongeler immédiatement les cellules mononucléaires périphériques humaines congelées (PBMC) en plaçant le cryocial dans un bain d’eau à 37 °C pendant 5 min.
2. Inverser le cryocial deux fois pour resuspender doucement les cellules et à l’aide d’une pipette de 1 mL transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL.
3. Ajouter 10 ml de milieu de croissance préchauffé (37 °C) complétés par 10 % de sérum bovin fœtal (RPMI-1640 + 10 % FBS) au tube de 15 mL contenant les PBMC.
4. Centrifugez la suspension cellulaire dans une centrifugeuse de seau balançant à température ambiante à une vitesse de 330 x g pendant 10 min avec accélération rapide et le frein à haute.
5. Une fois le spin terminé, décanter soigneusement le supernatant. Resuspendez le granulé cellulaire dans 3 mL de saline tampon phosphate (PBS) pH 7.2, contenant 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) en tapant sur le côté des tubes.
6. Mélanger les cellules en inversant le tube avec le bouchon bien fermé.
7. Préparer deux microtubes de 1,5 mL et utiliser une pipette aliquot 1,5 mL de la suspension cellulaire dans chaque tube, dont l’un est utilisé pour la coloration ultérieure de l’immunofluorescence et un pour l’extraction de l’ADN.

2. Protocole de coloration et d’imagerie de l’immunofluorescence

1. Resuspender les cellules (à partir de 1,7) dans 200 μL de tampon PBS contenant 0,1 % d’azure de sodium et 2 % de FBS et ajuster la concentration finale de la suspension cellulaire à un maximum de 2 x 10⁷ cellules/mL.
2. Divisez la suspension cellulaire en canalisant 100 μL de volume en deux microtubes séparés de 1,5 mL.
3. Ajouter 20 μL de volume anti-Hu CD3/CD4 conjugué avec l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et la phycoérythrine (PE) à un tube et anti-Hu CD4/CD25 conjugués avec fitc et pe (voir tableau des matériaux)au deuxième tube, respectivement.
4. Ajouter 1 goutte de tache de cellules fluorescentes bleues (voir tableau des matériaux)à chaque tube.
5. Incuber à température ambiante à l’aide d’un rotateur de tube pendant 2 h. Protégez-vous de la lumière.
6. Centrifuge la suspension cellulaire à température ambiante à 330 x g pendant 10 min avec accélération rapide et frein à haute.
7. Décanter le supernatant et resuspender soigneusement la pastille cellulaire en tapant sur le tube. Ajouter 1 mL de PBS, pH 7.2 contenant 2 mM EDTA. En veillant à ce que le bouchon soit bien fermé, mélangez les cellules en inversant le tube 2x.
8. Répétez les étapes 2.6 et 2.7 pour trois fois.
9. Resuspender les cellules dans 20 μL de PBS pH 7.2 contenant 2 mM EDTA.
10. Pipette 10 μL goutte de la suspension cellulaire sur une lame de microscope borosilicate et attendre 2 min pour les cellules de sédiments lentement au fond de la goutte.
11. Placez soigneusement un couvercle en verre sur la lame du microscope et placez la lame sur la scène d’un microscope inversé.
12. Enregistrez des images des cellules à l’aide d’un objectif 10x et d’une caméra EMCCD reliée au microscope pour chacun des fluorophores pour les deux échantillons de suspension cellulaire.
13. Compter manuellement les cellules étiquetées fluorescentes (voir Informations supplémentaires pour les données brutes).
14. Prenez le rapport entre les cellules étiquetées CD3 et anti-Hu CD4/CD25 et les cellules tachées par DAPI pour obtenir les proportions de CD3⁺ T-Cells et CD4⁺ CD25⁺ T-Regs par rapport au leucocyte total.

3. Extraction d’ADN et conversion de bisulfite

1. Extraction d’ADN
   REMARQUE : Extraire l’ADN des PBMC préparés à la section 1 à l’aide d’un kit de purification de l’ADNmagnétique (voir tableau des matériaux) suivant les procédures fournies par le fabricant.
   1. Dans un tube de 1,5 mL, suspendez les cellules dans 100 μL de PBS et ajoutez 20 μL de Proteinase K et 400 μL de tampon lysy/binding. Mélanger en faisant monter 10x, puis effectuer l’incubation à température ambiante pendant 5 min.
   2. Capturez le complexe de perles d’ADN en plaçant le tube sur un support magnétique pendant 1-2 min, puis retirez soigneusement et jetez le supernatant.
   3. Retirez le tube contenant le complexe de perles d’ADN de la grille magnétique et resuspendez les perles dans 600 μL de la #1 de tampon de lavage pour laver toute liaison non spécifique.
   4. Placez le tube à nouveau sur le support magnétique et retirez soigneusement et jetez le supernatant.
   5. Répétez les étapes 3.1.3 et 3.1.4 avec 600 μL de #2 tampon de lavage.
   6. Laisser le tube ouvert à l’air sec pendant 1 min.
   7. Retirez le tube de la grille magnétique et éliminez l’ADN en distribuant 100 μL de tampon d’ellion et en canalisant le complexe d’ADN/perle de haut en bas 20x.
   8. Placez le tube contenant l’ADN éluté à nouveau sur le support magnétique et incuber pendant 1-2 min pour séparer les perles magnétiques de l’ADN éluté.
   9. Transférer la solution d’ADN purifiée éluté dans un nouveau tube propre.
   10. Évaluer la concentration de l’échantillon d’ADN purifié en mesurant l’absorption à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
2. Conversion de bisulfite
   REMARQUE : Effectuer la conversion de bisulfite sur l’ADN purifié à l’aide d’un kit de méthylation (voir tableau des matériaux)suivant les procédures fournies par le fabricant.
   1. À 20 μL d’échantillon d’ADN (200-500 ng) dans un tube PCR ajouter 130 μL de réactif de conversion. Bien mélanger et tourner brièvement vers le bas.
   2. Transférer le tube PCR sur un cycleur thermique et effectuer le protocole de cyclisme comme suit : 98 °C pendant 8 min; 54 °C pendant 60 min et tenir à 4 °C.
   3. Ajouter 600 μL de la mémoire tampon de liaison à une colonne de chromatographie des ions (IC) placée dans un tube de collecte.
   4. Ajoutez l’échantillon d’ADN à la colonne IC contenant le tampon de liaison et mélangez en inversant le tube plusieurs fois. Centrifugeuse pour 30 s à pleine vitesse. Jetez le débit collecté.
   5. Dans la colonne, ajoutez maintenant 100 μL de tampon de lavage. Effectuez la centrifugation telle que décrite à l’étape 3.2.4 et jetez le flux.
   6. Ajouter 200 μl de tampon de desulfonation et effectuer l’incubation à température ambiante pendant 15-20 min. Centrifuge et jetez le débit tel que décrit à quelques étapes ci-dessus.
   7. Ajoutez 200 μL de tampon de lavage à la colonne. Centrifugeuse à pleine vitesse pendant 30 s et jeter le flux à travers.
   8. Répétez l’étape 3.2.7.
   9. Transférer la colonne dans un nouveau tube de collecte de 1,5 mL et ajouter 100 μL d’eau de qualité PCR sur la membrane de la colonne. Centrifugeuse à pleine vitesse pendant 1 min pour éliser l’ADN.
   10. Évaluer la concentration de l’échantillon d’ADN converti en bisulfite en mesurant l’absorption à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
       REMARQUE : Utilisez une valeur de 40 μg/mL pour l’absorption à 260 nm = 1,0.
   11. Conserver l’ADN à -20 °C pour un stockage à court terme ou à -70 °C pour un stockage à long terme.

4. Fabrication d’appareils de génération de gouttelettes

REMARQUE : Un dispositif microfluidique utilisé pour la génération de gouttelettes (fichier CAO fourni dans l’information supplémentaire)a été fabriqué dans un environnement de pièce propre (classe 1 000) dans l’élastomère thermoplastique (voir tableau des matériaux)à l’aide de gaufrage à chaud généré par le protocole suivant.

1. Fabrication de moules SU-8
   1. Préparez un moule SU-8 sur une plaquette de silicium de 6 pouces en utilisant la photolithographie standard comme indiqué ci-dessous.
   2. Nettoyez une plaquette de silicium de 6 po à l’aide de plasma à oxygène à 500 W pour 10 s.
   3. Le spin-coat SU-8 résiste sur la plaquette de silicium à 900 tr/min pendant 40 s pour atteindre une épaisseur totale du film de 100 μm.
   4. Placer la gaufrette sur une plaque chaude et pré-cuire pendant 15 min à 65 °C, suivie de 2 h à 95 °C.
   5. Exposer à la lumière UV à 365 nm (Hg i-line) à travers un photomask haute définition de transparence en utilisant une dose d’exposition de 1000 mJ/cm².
   6. Placer la gaufrette sur une plaque chauffante et après le cuisson pendant 15 min à 65 °C, puis 40 min à 95 °C.
   7. Développer par immersion dans propylène glycol monométhylique acétate (PGMEA) pendant 5 min.
   8. Rincer au PGMEA et à l’isopropanol et sécher avec un jet de gaz azoté.
   9. Déposer la gaufrette sur une plaque chauffante et cuire au four pendant 2 h à 135 °C.
   10. Silaniser la plaquette dans le désiccateur à vide contenant une goutte d’agent silanisant (tricholoro perfluorooctyl silane) placé sur une lame de microscope en verre adjacente pendant 2 h.
       REMARQUE : Ceci est fait pour faire des silanes former une monocouche sur la surface du maître SU-8. Le silane de perfluorooctyl de Trichorolo doit toujours être manipulé dans le capot de fumée et tenu à l’écart des sources d’eau.
2. Réplique de Polydiméthylsiloxane (PDMS)
   1. Préparer les prépolymères liquides de PDMS (voir tableau des matériaux)à un rapport w/w de 10:1 de base d’élastomère à l’agent de durcissement dans une tasse en plastique.
   2. Placer la tasse dans un mélangeur à vide centrifuge planétaire pour mélanger et dégazer le mélange PDMS.
   3. Verser le mélange PDMS sur le moule placé dans le support métallique personnalisé qui empêche les fuites de résine et la cure à 65 °C pendant 2 h.
   4. À l’aide de pinces à épiler, éplucher soigneusement le moule PDMS du maître SU-8.
3. Moule époxy
   NOTE : Un moule époxy a été fabriqué à partir du maître SU-8/silicium à l’aide d’un processus de réplication intermédiaire avec PDMS.
   1. Préparer la résine époxy (voir tableau des matériaux) à l’aided’un rapport de 100/83 w/w de résine/durcisseur.
   2. Dégazer le mélange sous pression réduite à l’aide d’un four à séchage sous vide pendant 30 min.
   3. Verser la résine sur la réplique PDMS et la guérir à 80 °C pendant 12 h.
   4. Retirer le moule époxy séché de la réplique PDMS, placer sur une plaque chauffante et cuire dur pendant 2 h à 120 °C.
4. Dispositif TPE
   1. Extrudez les granulés de TPE (voir Tableau des matériaux)à 165 °C en feuilles de 2,0 mm d’épaisseur et 7 po de large de plusieurs mètres de longueur et les entreposez comme un rouleau pour une utilisation future.
   2. Couper la feuille TPE du rouleau à l’aide de ciseaux dans un carré de 7 po.
   3. Placez la feuille de TPE entre le moule époxy et une plaquette de silicium silanisée non à motifs (voir étape 4.1.10 pour la procédure de silanisation des plaquettes).
   4. Effectuer un gaufrage à chaud à une température de 125 °C, une force appliquée de 10 kN et une pression de 10^{à 2} mbar pendant 10 min.
   5. Demold soigneusement à température ambiante à l’aide de spray au méthanol pour séparer le TPE en relief de la plaquette de silicium et le moule époxy.
   6. Couper une autre feuille carrée de 7 pouces de TPE et le placer entre deux plaquettes de silicium silanisées non modelées.
   7. Effectuer un gaufrage à chaud à une température de 140 °C, une force appliquée de 10 kN et une pression de 10^{à 2} mbar pendant 10 min pour former une surface planaire pour fermer les canaux et sceller l’appareil.
   8. Demold soigneusement à température ambiante à l’aide de spray au méthanol pour séparer le TPE en relief des deux plaquettes de silicium.
   9. Coupez chacune des feuilles de TPE en relief à la taille de l’appareil à l’aide d’une lame de médecin.
   10. Percer les trous d’accès pour les canaux d’entrée et de sortie dans l’appareil structuré à l’aide d’une aiguille de poinçon de biopsie de 1 mm avec un piston.
   11. Enfermez les canaux en plaçant un dispositif TPE planaire en contact direct avec les canaux à température ambiante.
   12. En option, placer dans un four à 70 °C pendant 2 h pour favoriser le collage des appareils.
   13. Adapter les trous d’accès avec un tube fluide jetable (I.D. 0,25 mm, O.D. 0,8 mm). Sceller les joints à l’aide d’une colle époxy pour assurer une manipulation à l’épreuve des fuites.

5. Génération de gouttelettes et PCR

REMARQUE : Le tableau 1 décrit l’information sur les amorces avant et inverse ainsi que les sondes d’hydrolyse à double extinction pour les gènes C-LESS, CD3Z et Foxp3, qui sont nécessaires pour l’amplification multiplexe des cibles génétiques déméthylées.

1. Préparer le mélange principal tel que décrit dans le tableau 2.
2. Décongeler tous les composants du mélange principal à l’exception du mélange d’enzymes. Mélanger le mélange principal à fond en faisant tourner vers le haut et tourner brièvement vers le bas.
3. Ajouter le volume approprié (1 μL) de l’ADN converti en bisulfite (à partir de la section 3.2) pour le mélange principal dans un tube PCR. Mélanger la réaction en faisant tourner vers le haut et tourner vers le bas brièvement.
4. Connectez les tubes fluides jetables (I.D. 0,25 mm, O.D. 1,6 mm) à deux seringues en verre de précision (250 μL de volume) à l’aide de raccords PEEK.
5. Préfabler une seringue en verre de précision avec 250 μL d’huile porteuse contenant 5 % de fluoro-surfactant.
6. Préfabler une autre seringue en verre de précision avec 50 μL d’huile porteuse avant de charger 100 μL du mélange PCR pour assurer la distribution de l’ensemble du volume de l’échantillon pendant l’émulsification.
7. Installez un dispositif microfluidique de gouttelette sur une scène d’un microscope léger droit équipé d’une caméra haute vitesse pour observer et enregistrer la formation de gouttelettes en temps réel.
8. Placez les seringues préremplies sur la pompe à seringues programmables et utilisez l’union PEEK avec des raccords (voir tableau des matériaux),connectez le tube des seringues aux tubes des canaux d’entrée respectifs du dispositif microfluidique de gouttelette.
9. Placez le tube à partir de la sortie du générateur de gouttelettes à l’intérieur d’un tube PCR de 0,5 mL.
10. Ajuster le débit de la pompe à seringue à 2 μL/min et laisser la taille des gouttelettes se stabiliser avant de recueillir l’émulsion qui en résulte.
11. Recueillir l’émulsion et transférer 75 μL à un tube PCR de 0,2 m L pour le cycle thermique.
12. Assurez-vous que la teneur en huile du tube PCR correspond étroitement au volume de la phase dispersée afin d’éviter la coalescence des gouttelettes pendant le cycle thermique.
13. Placez le tube PCR de 0,2 mL dans le cycleur thermique et effectuez le protocole de cycle comme suit : préchauffage à 95 °C pendant 5 min, puis 45 cycles de dénaturation à 95 °C pour 15 s et annealing/extension à 60 °C pendant 30 s.
14. Utilisez l’émulsion restante pour remplir un tube capillaire borosilicate (profondeur de 100 μm) avec un profil rectangulaire afin d’imager les gouttelettes et d’évaluer le diamètre des gouttelettes.
15. Placez le tube de borosilicate rempli de l’émulsion sur une lame de microscope. Utilisez un microscope inversé équipé d’une caméra EMCCD et d’un objectif 10x pour enregistrer des images lumineuses des gouttelettes sur le terrain.
16. Mesurez le diamètre des gouttelettes à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image comme indiqué ci-dessous.
17. Définissez l’échelle de la distance connue en microns correspondant au nombre de pixels de l’image en sélectionnant le bouton «Analyser», puis «Définir l’échelle».
18. Convertissez l’image en gris en sélectionnant le bouton 'Image',puis 'Type'. Ajustez la luminosité et le contraste si nécessaire. Définissez un seuil manuel pour délimiter et remplir les cercles en sélectionnant le bouton «Image», puis «Ajuster le seuil».
19. Analyser les particules en sélectionnant le bouton ' Analyser lesparticules' et en fixant la circularité à 0,75 – 1.
20. Obtenez la zone résultante et le diamètre des gouttelettes mesurées qui s’affiche automatiquement dans le logiciel.
21. Calculer le diamètre moyen des gouttelettes et en supposant une gouttelette sphérique, estimer le volume de partition, qui sera utilisé pour calculer la concentration cible absolue.
22. Assurez-vous que les gouttelettes sont monodispersées en analysant le coefficient de variation (CV) qui est considéré comme le rapport des écarts types aux valeurs moyennes(k = 1), pour le diamètre des gouttelettes (< 3%).

6. Imagerie de fluorescence et analyse d’image

1. Imagerie par fluorescence
   1. Après amplification, transférer l’émulsion pcr dans le tube capillaire borosilicate (50 μm de profondeur) avec un profil rectangulaire afin d’organiser les gouttelettes dans une monocouche emballée à proximité pour l’imagerie.
   2. Fixer les capillaires remplis sur une lame de microscope et sceller les deux côtés à l’aide d’un adhésif acrylique UV. Appliquez une source de lumière UV sur l’adhésif UV en prenant soin de ne pas éclairer l’émulsion pour éviter de blanchir l’échantillon.
   3. Chargez la lame de verre sur un microscope inversé équipé d’une caméra EMCCD et d’un objectif 10x.
   4. À l’aide d’un logiciel d’imagerie au microscope, sélectionnez Acquérir | Live - Rapide pour démarrer l’acquisition de la caméra en temps réel, observer l’échantillon, et s’assurer que la largeur du capillaire est capturé.
   5. Réglez la lampe de champ lumineuse pour l’éclairage diascopique à 3,5 V.
   6. Réglez la lampe fluorescente LED à large spectre pour l’éclairage épiscopique à 20% d’intensité.
   7. Ajuster manuellement le paramètre de capture pour toutes les longueurs d’onde (Champ lumineux, FAM, HEX et Cy5) en sélectionnant l’étalonnage | Commande Configurations optiques dans le logiciel d’imagerie. Pour chaque fluorophore, le cube de filtre de fluorescence correspondant doit être commuté manuellement. Un cube de filtre pour l’imagerie de champ lumineux doit être utilisé pour garder le même chemin optique.
   8. Ajuster manuellement le temps d’exposition avant l’acquisition d’images à l’aide d’Acquire | Commande Paramètres de la caméra pour chaque fluorophore résumée dans le tableau 3. Définissez le mode de lecture EM gain 17 MHz à 16 bits avec un multiplicateur de gain de 100 dans le menu « Paramètres decapture» du logiciel.
   9. Dans la fenêtre LUT du logiciel, définissez l’échelle des LUT de telle sorte que le signal de transmission soit compris dans la plage définie. Dans cette expérience, l’échelle a été fixée de 500 à 12.000 environ.
   10. Automatisez la capture à l’aide d’un programme d’acquisition multipoint à l’aide d’une analyse XY et de plusieurs options de longueur d’onde dans cet ordre spécifique. Assurez-vous que l’étape se déplace vers la position initiale, capturez toutes les différentes longueurs d’onde, puis passez à la position suivante.
   11. Tout d’abord, configurer l’analyse XY en personnalisant le profil d’analyse XY dans le menu d’analyse XY du logiciel. Dans 'Custom Multipoint Definition', choisissez la grande boîte de définition d’image et réglez-la à 40,0 x 1,0 mm approximativement (la longueur du remplissage d’émulsion). Utilisez 1% de chevauchement.
   12. Activez l’option «Utiliser la surface de mise au point» et configurer la courbe de surface de mise au point en ajustant le plan de mise au point à différents points de l’échantillon à l’aide du bouton de mise au point sur le microscope.
   13. Deuxièmement, configurez l’analyse de longueur d’onde multiple en sélectionnant l’onglet analyse. Ajoutez chacune des configurations optiques créées à l’étape 6.1.7 pour chaque longueur d’onde.
   14. Cliquez sur l’option pour fermer l’obturateur actif pendant le mouvement de l’étape et pendant le changement de filtre pour éviter de blanchir l’échantillon et exécuter l’acquisition en appuyant sur le bouton «Démarrer l’exécution». Exportez chaque cadre d’acquisition dans des fichiers tiff et divisez chaque canal en un fichier séparé à l’aide de l’option fractionnée de plusieurs fichiers et en appliquant des paramètres de LUT enregistrés. Utilisez le nom du point et l’option nom du canal pour différencier facilement chaque fichier d’image.
2. Analyse d’image
   1. Trier toutes les images acquises par des filtres brightfield et fluorescence à télécharger dans un logiciel d’analyse d’images open source.
   2. Utilisez un logiciel d’analyse d’images pour créer un pipeline afin d’identifier toutes les gouttelettes à l’aide d’images brightfield, puis mesurer l’intensité des gouttelettes fluorescentes associées.
   3. Pour pipeline, téléchargez des images de tiff brightfield et fluorescence, puis ajoutez des modules 'ColorToGray', 'IdentifyPrimaryObjects', 'MeasureObjectIntensity', et 'ExportToSpreadsheet'. Utilisez des images de gouttelettes brightfield pour identifier des objets, puis utilisez des objets comme masque pour mesurer l’intensité des images fluorescentes.
   4. Exécutez le pipeline avec des images tiff sélectionnées pour extraire l’intensité moyenne de fluorescence des images de gouttelettes de fluorescence. Mener l’expérience en triple, avec chaque ensemble composé d’environ 5.000 gouttelettes pour l’analyse.
   5. Appliquez l’algorithme 'definetherain' (http://definetherain.org.uk/) pour identifier les clusters de gouttelettes positifs et négatifs. Les points positifs doivent se situer dans les 3 écarts types de la moyenne. Cela détermine l’intensité seuil des gouttelettes positives à utiliser pour le comptage.
   6. Utilisez encore une fois le logiciel d’analyse d’images pour implémenter un nouveau pipeline où le seuil de fluorescence pour chaque cible de gène est défini dans l’étape précédente.
   7. Téléchargez des images lumineuses et fluorescentes dans le pipeline. Ajouter des modules 'ColorToGray', 'RescaleIntensity', 'Threshold', 'IdentifyPrimaryObjects', 'MeasureObjectsizeShape', 'FilterObjects', et 'ExportToSpreadsheet'. Créez des modules uniques pour les images brightfield et chaque filtre de fluorescence pour les gouttelettes.
   8. Redimensionnez l’échelle d’intensité de l’image de 0 à 1 pour chaque groupe d’images de fluorescence. Définissez ensuite le seuil pour identifier et compter les objets au-dessus du seuil établi. Si nécessaire, ajoutez le module 'ExpandOrShrinkObjects' pour réduire les objets afin de faciliter le comptage et l’identification des gouttelettes dans les champs lumineux.
   9. Identifiez uniquement les objets de la taille sélectionnée de 20 à 30 pixels et filtrez les objets comptés pour ne retenir que les objets d’un diamètre spécifique (c.-à-d. des gouttelettes dans la gamme de 75 μm de diamètre) et une excentricité sphérique ronde de 0,5 et moins.
   10. Exporter les résultats vers un tableau qui répertorie le nombre total de gouttelettes à partir d’images de champs lumineux, ainsi que le nombre de gouttelettes de tous les canaux de fluorescence utilisés; à savoir Cy5 pour le gène C-LESS, HEX pour le gène CD3Z méthylé et FAM pour le gène MÉTHYLÉ FOXP3 (voir Informations supplémentaires pour les données expérimentales brutes obtenues pour l’essai mdPCR présenté).
   11. Calculer le rapport des gouttelettes négatives pour chaque cible de gène et appliquer la distribution de Poisson pour obtenir les copies respectives par gouttelette (CPD) à l’aide de l’équation 1 :
       
       où x représente le nombre de gouttelettes contenant 0, 1, 2 molécules ou plus, et λ représente la valeur de la DPC.
   12. Calculer, la concentration cible absolue en prenant le rapport de la valeur cpd et le volume de gouttelettes obtenus à l’étape 5.20 avec l’équation 2:
       
       où la valeur (1-p) représente la fraction des gouttelettes négatives.
   13. Calculez le pourcentage de CD3⁺ Lymphocytes T et CD4⁺ CD25⁺ T-Regs en divisant les valeurs CPD respectives des gènes CPD et FOXP3 méthylés par la valeur C-LESS – ou cellule totale – CPD (voir informations supplémentaires pour les calculs de CPD à partir de données brutes).
   14. Comparez ces valeurs en pourcentage à celles obtenues à partir de l’imagerie immunofluorescence à l’aide d’anticorps pour le comptage CD3⁺ T-Cell et CD4⁺ CD25⁺ T-Reg.

Résultats

Le générateur de gouttelettes microfluidiques à base de TPE a été fabriqué à l’aide du protocole décrit comme indiqué à la figure 1. Un masque de transparence a été utilisé en photolithographie pour obtenir le silicium (Si) maître. La lithographie douce a été exécutée pour obtenir une réplique inverse de PDMS du maître de Si qui a ensuite été employée pour fabriquer le moule époxy. Le précurseur d’époxy a été versé sur le PDMS et guéri pour le crosslink et l...

Discussion

Le protocole et les méthodes expérimentaux présentés permettent le mdPCR interne à l’aide d’un générateur de gouttelettes TPE fabriqué, d’un cycleur thermique et d’un microscope à fluorescence. L’appareil fabriqué utilisant le TPE doux au collage TPE offre des propriétés de surface hydrophobes qui sont uniformes sur tous les murs du canal, de sorte que le dispositif final ne nécessite aucun traitement de surface pour une utilisation ultérieure comme générateur de gouttelettes. Ce matériel a ét...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201	PCR tube
RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluoroSurfactant	Fluoro-surfactant
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, UK		EMCCD camera
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		Used for fluorescence image analysis
Nikon, Japan		10x objective
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
Fisher, Canada
Vitrocom, NJ, USA	5015 and 5010	Borosilicate capilary tube
(http://definetherain.org.uk/)
Hamamatsu, Japan	LC-L1V5	DEL UV light source
Dolomite	3200063	Disposable fluidic tubing
Dolomite	3200302	Disposable fluidic tubing
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		Upright light microscope
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schärding, Austria
Zymo Research, Irvine, CA	D5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, Switzerland		SU-8 photoresist
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Germany	203603
Image J		Used to assess droplet diameter
Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, USA		Broad-spectrum LED fluorescent lamp
Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC	DE1010
Hexpol TPE, Åmål, Sweden		Thermoplastic elastomer (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, Japan		Used for image acquisition
3M, St Paul, MN		Carrier Oil
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	Blue fluorescent live cell stain (DAPI)
IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA	P-881	PEEK fittings
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, USA	ARV 310
Ihc world, Maryland, USA	IW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA	2607808
Cetoni GmbH, Korbussen, Germany
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	484431
Bio-Rad, Mississauga, ON	1861096
Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON
Nikon, Melville, NY		Inverted microscope
Nikon, Japan
Loctite	AA 352