Évaluation de l’effet des pesticides sur les larves des abeilles solitaires

Résumé

Le présent protocole explique une méthode pour nourrir les larves des abeilles solitaires, Osmia excavata, contaminées par des pesticides. La procédure examine l’écotoxicité du pesticide pour les larves des abeilles solitaires.

Résumé

Les évaluations actuelles des risques écologiques des pesticides sur les pollinisateurs n’ont principalement tenu compte que des conditions de laboratoire. Pour les larves d’abeilles solitaires, l’ingestion de provisions contaminées par des pesticides peut augmenter le taux de mortalité des larves, diminuer le taux de collecte et la population d’abeilles solitaires adultes au cours de la prochaine année d’un point de vue démographique. Mais il existe peu d’études sur les effets des pesticides sur les larves d’abeilles solitaires. Par conséquent, comprendre comment les pesticides influencent les larves d’abeilles solitaires devrait être considéré comme faisant partie intégrante de l’évaluation des risques écologiques des pesticides. Cette étude présente une méthode pour exposer les larves d’abeille solitaire, Osmia excavata , à des doses létales ou sublétales de pesticide, en suivant le gain de poids larvaire, la durée de développement, la capacité d’éclosion et la conversion de l’efficacité de la consommation alimentaire des aliments ingérés. Pour démontrer l’efficacité de cette méthode, les larves d’O. excavata ont été nourries avec des provisions contenant des doses aiguës létales et sublétales de chlorpyrifos. Ensuite, les indices ci-dessus des larves traitées ont été étudiés. Cette technique aide à prédire et à atténuer le risque des pesticides pour les pollinisateurs.

Introduction

Les pollinisateurs jouent un rôle essentiel dans les services écosystémiques de l’agriculture mondiale moderne. Alors que les abeilles mellifères (Apis mellifera; Hyménoptères: Apidae) ont traditionnellement été considérés comme les pollinisateurs économiques essentiels des cultures, des recherches récentes suggèrent que Osmia (Hyménoptères: Megachilidae) est également très important pour améliorer la pollinisation de certaines cultures, augmenter la taille des fruits et le nombre de graines, et réduire la proportion de fruits asymétriques dans les vergers commerciaux dans différentes parties du monde¹. Osmia excavata a été considéré comme une espèce idéale pour la pollinisation des pommes, principalement en Asie, comme dans le nord et le nord-ouest de la Chine et au Japon ^2,3,4. Il peut fournir des services de pollinisation pour certaines cultures avec une efficacité similaire ou parfois plus efficace. À cet égard, il a été démontré qu’elles remplacent ou travaillent en synergie avec les abeilles mellifères ^4,5,6.

Les caractéristiques biologiques d’O. excavata sont uniques par rapport aux abeilles sociales. Son activité univoltine, solitaire et de nidification se produit principalement au printemps et au début de l’été. Les nids d’O. excavata se trouvent généralement dans des trous préexistants, généralement dans le bois mort, les plantes creuses, les tubes de paille et la tige de bambou à l’état naturel³. O . excavata adulte émerge de son cocon pour s’accoupler, ramasser du pollen et construire un nid pour pondre des œufs, qui commencent à éclore une semaine plus tard. Les œufs fécondés se développent en femelles, tandis que les œufs non fécondés se développent en mâles³. Les femelles sont réparties dans le fond du tube d’abeille et les provisions correspondantes sont plus importantes. En revanche, les mâles étaient à proximité de la sortie du tube avec des provisions mineures⁷, de sorte que les mâles sortent en premier, et les femelles sortent plus tard. La femelle mélange le pollen avec une petite quantité de nectar dans une tache humide, la seule source de nourriture pour chaque larve de la cellule⁸.

Plusieurs études ont rapporté une diminution de la population d’insectes pollinisateurs ^9,10. L’utilisation intensive de pesticides a été identifiée comme l’un des principaux facteurs de réduction de l’abondance et de la diversité des pollinisateurs et peut également mettre en danger les services de pollinisation^11,12. Pour réduire et atténuer les effets néfastes des pesticides, il est nécessaire de procéder à une évaluation des risques liés aux pesticides pour les pollinisateurs. Certains pays ont établi des cadres réglementaires pour assurer la sécurité des abeilles contre les pesticides utilisés^13,14. Des études récentes ont montré qu’Osmia était plus sensible aux pesticides que les abeilles mellifères ^1,15.

Fait intéressant, la plupart des évaluations des risques étaient axées sur les abeilles mellifères adultes^11,12; peu de recherches ont été menées sur O. excavata, en particulier les larves. De plus, la mortalité d’Osmia directement causée par les pesticides est le plus souvent considérée comme¹⁶. Pourtant, les toxicités chroniques telles que le gain de poids larvaire, la durée du développement, les habitudes alimentaires, la capacité d’éclosion, le comportement ultérieur des adultes et la fécondité peuvent avoir les mêmes dommages que les toxicités létales aiguës et sont souvent ignorées en raison de l’absence d’une méthode expérimentale efficace pour les abeilles solitaires¹⁷.

Jusqu’à présent, deux méthodes sont utilisées pour évaluer les effets des pesticides sur les larves d’abeilles solitaires: (1) une quantité appropriée de pesticide a été appliquée à l’endroit localisé des provisions sans enlever l’œuf des abeilles solitaires 1,18,19,20; 2° remplacer les dispositions par des mélanges artificiels pollen-nectar contenant une quantité déterminée de pesticide²¹. Cependant, il existe certaines limites aux deux méthodes ci-dessus. Le premier ne peut mesurer que la toxicité aiguë, mais pas la toxicité chronique parce que les larves ont ingéré la totalité de la dose dans un court laps de temps; ce dernier conduirait à un taux de mortalité élevé en raison de manipulations^{humaines 1}. Ici, la méthode d’immersion a été décrite pour étudier l’écotoxicité des pesticides à O. excavata dans des conditions de recherche hautement contrôlées en simulant le comportement des larves se nourrissant de pesticides résiduels dans les provisions dans l’environnement réel. La méthode de cette étude résout les inconvénients des deux méthodes ci-dessus et convient à la mesure des effets d’une substance dangereuse sur la toxicité aiguë et chronique.

Protocole

1. Préparation de la sonde d’alimentation

1. Percez un trou (~0,3 mm de diamètre) dans le couvercle d’un tube de centrifugeuse de 2 mL à l’aide d’un fer à enroulement électrique (voir tableau des matériaux). Utilisez un tel tube de centrifugeuse pour maintenir une larve d’O. excavata et sa masse d’approvisionnement.

2. Préparation du pesticide

1. Dissoudre le pesticide de qualité technique (voir tableau des matériaux) dans de l’acétone pour acquérir des solutions mères de 1 x 10⁴ μg d’i.a. ^mL-1. Ensuite, effectuez des dilutions de gradient de la solution à plus de cinq concentrations.
   NOTE : Des chlorpyrifos à 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4 μg a.i. ^mL-1 ont été utilisés dans cette étude.

3. Préparation des dispositions

1. Acquérir des tubes d’abeilles en plastique contenant des provisions (voir tableau des matériaux) et des larves nouvellement écloses d’O . excavata dans le cadre d’un programme d’élevage en masse.
   REMARQUE: Aucun pesticide n’a été utilisé de 20 jours avant la floraison jusqu’à toute la période de floraison; les résultats des analyses chimiques ont montré que les teneurs en pesticides couramment utilisées dans cinquante dispositions sélectionnées au hasard étaient toutes deux inférieures aux niveaux d’essai minimaux.
2. Séparez doucement les provisions et les larves à l’aide d’une brosse douce. Sélectionnez les larves femelles en fonction de la taille de l’approvisionnement et de la position de la cellule dans le nid⁹. Ensuite, placez des provisions de taille uniforme et des larves femelles sélectionnées dans des boîtes de Pétri (60 mm de diamètre) et mettez-les de côté pour utilisation.
   NOTE: Cinquante dispositions ont été choisies au hasard pour analyser le contenu des pesticides couramment utilisés: chlorpyrifos, imidaclopride, fendifenuron, phoxim, avermectine. Les paramètres de la brosse souple sont (a) le diamètre de la brosse: 0,3 mm, (b) la longueur de la brosse: 2 cm, (c) la longueur du stylo: 18 cm.

4. Fournir un traitement avec un pesticide

1. Faire tremper les provisions sélectionnées de taille uniforme (à partir de l’étape 3.2) dans un pesticide dilué (à partir de l’étape 2.1; chlorpyrifos à 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4 μg a.i. ^mL-1) pendant 10 s à l’aide d’une cage. Tremper le contrôle (CK) dans un solvant à 0,2 % (acétone dans cette étude).
   REMARQUE : Il y a trois répétitions par traitement par concentration, et chaque répétition comprenait 60 provisions. La différence de dosage de chaque disposition peut être réduite en sélectionnant des dispositions de taille uniforme.
2. Mesurer le volume de la solution de pesticide avant et après le traitement des provisions avec le pesticide. Ensuite, calculez le volume immergé d’insecticide dans chaque traitement, y compris 60 provisions de masse (tableau supplémentaire 1). Placer les provisions dans des tubes centrifuges séparés avec des trous (à partir de l’étape 1.1) après séchage à l’air sur une table de travail stérile.
   REMARQUE: Avant l’expérience, mettez les cages contenant les provisions dans la solution de pesticide, puis mesurez le volume de solution de pesticide avant et après le trempage pour éliminer l’erreur.
3. Transférer les larves femelles individuellement à la surface des provisions séchées naturellement à l’aide d’une brosse douce.
   REMARQUE: Une larve dans un tube.

5. Conditions de croissance

1. Élevez les larves d’O. excavata dans une chambre de croissance dans l’obscurité, avec 65% à 75% d’humidité relative et 25 ± 2 °C¹⁶.

6. Examen des résultats

1. L’essai de toxicité létale aiguë
   1. Mesurer la mortalité des larves après les avoir placées sur les provisions traitées et de contrôle (CK) pendant 48 h.
      NOTE: Les critères de décès: lorsque les larves n’ont pas répondu au toucher doux à l’aide d’une brosse douce sous des lampes à lumière noire²². Des lampes à lumière noire ont été utilisées pour simuler les conditions de croissance sombres des larves et éviter l’influence de la lumière sur les larves lors de la vérification des indicateurs de croissance. Pour éliminer l’erreur humaine, les mortalités avec et sans retrait des larves des provisions après 48 h dans les groupes témoins ont également été mesurées.
   2. Peser 60 provisions avant et après 48 h d’essais d’élevage d’insectes pour déterminer la quantité de provisions consommée par chaque larve.
   3. Calculer la dose de pesticide à chaque concentration consommée par chaque larve en fonction du pourcentage de provisions consommées et de la teneur en pesticides de chaque fourniture.
      REMARQUE: L’équation pour le calcul de la dose est^{de 23}:
      
      où, D est la dose consommée de pesticide par chaque larve; W1 est le poids de 60 provisions avant l’infusion de pesticide; W2 est le poids restant de 60 provisions après 48 h; V1 est le volume de pesticide avant immersion pour 60 provisions; V2 est le volume de pesticide après immersion pour 60 provisions; C est la concentration du pesticide.
2. L’essai de toxicité sublétale
   1. Peser les larves avant les essais d’élevage et après 14 jours de traitements pour déterminer le gain de poids larvaire.
   2. Observez O. excavata quotidiennement pendant le cocooning sous des lampes à lumière noire pour mesurer la durée de développement larvaire.
   3. Peser les portions restantes des provisions après 14 jours d’alimentation sur les provisions traitées et les provisions CK pour calculer la consommation et l’efficacité de la conversion des aliments ingérés (ICE)²⁴.
   4. Examinez le nombre d’éclosions en tirant sur les cocons à l’aide d’un petit ciseau lorsque les abeilles témoins émergent chez les adultes.

Résultats

Les teneurs en pesticides couramment utilisés, chlorpyrifos, imidaclopride, fendifenuron, phoxim, avermectine dans les provisions étaient inférieures à la limite de quantification (0,01-0,02 mg ^kg-1) dans le groupe témoin; ces résultats excluent l’influence des résidus de pesticides sur chaque traitement. La mortalité avec et sans retrait des larves des provisions après 48 h dans les groupes témoins a été évaluée; les résultats n’ont montré aucune différence significative (tableau ...

Discussion

Pour les pollinisateurs adultes, il existe deux méthodes principales pour mesurer l’écotoxicité des pesticides. L’un est la méthode de contact, dans laquelle le pesticide est appliqué sur le prothorax des insectes adultes; l’autre est la méthode de toxicité gastrique, dans laquelle les pollinisateurs adultes sont nourris avec de l’eau de miel contenant du pesticide^25,26. Au cours des dernières années, il a été constaté que l’effet de pollini...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Abamectin	Jinan Lvba Pesticide Co. Ltd
Black-light lamps	Kanghua Medical Device Co., Ltd
Centrifugal tube box with 100 Wells	Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd
Centrifuge tube	Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd		2 mL;  Serve as bee tube
Electric soldering iron	Kunshan Kaipai Hardware Electromechanical Co., Ltd
Electronic scale	Sartorius Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd	3137510295
Graduated cylinder	Anhui Weiss Experimental Equipment Co. Ltd
Petri dishes (60 mm diameter)	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Pollen provision	Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd
Soft brush	Wengang Wenhai painting material factory
Solitary bees	Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd