Valutare l'effetto dei pesticidi sulle larve delle api solitarie

Riepilogo

Il presente protocollo spiega un metodo per alimentare le larve delle api solitarie, Osmia excavata, con disposizioni contaminate da pesticidi. La procedura esamina l'ecotossicità del pesticida alle larve delle api solitarie.

Abstract

Le attuali valutazioni del rischio ecologico dei pesticidi sugli impollinatori hanno considerato principalmente solo le condizioni di laboratorio. Per le larve delle api solitarie, l'ingestione di provviste contaminate da pesticidi può aumentare il tasso di mortalità delle larve, diminuire il tasso di raccolta e la popolazione di api solitarie adulte nel prossimo anno da una prospettiva demografica. Ma ci sono studi limitati sugli effetti dei pesticidi sulle larve delle api solitarie. Pertanto, capire come i pesticidi influenzano le larve delle api solitarie dovrebbe essere considerato parte integrante della valutazione del rischio ecologico dei pesticidi. Questo studio presenta un metodo per esporre le larve dell'ape solitaria, Osmia excavata , a dosi letali o subletali di pesticidi, monitorando l'aumento di peso larvale, la durata dello sviluppo, la capacità di eclosione e la conversione dell'efficienza del consumo alimentare del cibo ingerito. Per dimostrare l'efficacia di questo metodo, le larve di O. excavata sono state alimentate con provviste contenenti dosi acute letali e subletali di clorpirifos. Quindi, sono stati studiati gli indici di cui sopra delle larve trattate. Questa tecnica aiuta a prevedere e mitigare il rischio di pesticidi per gli impollinatori.

Introduzione

Gli impollinatori svolgono un ruolo fondamentale nei servizi ecosistemici della moderna agricoltura globale. Mentre le api mellifere (Apis mellifera; Gli imenotteri: Apidae) sono stati tradizionalmente considerati come gli impollinatori economici essenziali delle colture, recenti ricerche suggeriscono che Osmia (Hymenoptera: Megachilidae) è anche molto importante nel migliorare l'impollinazione per alcune colture, aumentando le dimensioni dei frutti e il numero di semi e riducendo la proporzione di frutta asimmetrica nei frutteti commerciali in diverse parti del mondo¹. Osmia excavata è stata considerata una specie ideale per l'impollinazione delle mele, principalmente in Asia, come nel nord e nord-ovest della Cina e in Giappone ^2,3,4. Può fornire servizi di impollinazione per alcune colture con efficienza simile o talvolta con maggiore efficienza. A questo proposito, è stato dimostrato che sostituiscono o lavorano in sinergia con le api^{mellifere 4,5,6}.

Le caratteristiche biologiche di O. excavata sono uniche rispetto alle api sociali. La sua attività univoltina, solitaria e di nidificazione si verifica principalmente in primavera e all'inizio dell'estate. I nidi di O. excavata si trovano di solito in fori preesistenti, tipicamente in legno morto, piante cave, tubi di paglia e gambo di bambù nella condizione naturale³. L'adulto O. excavata emerge dal suo bozzolo per accoppiarsi, raccogliere polline e costruire un nido per deporre le uova, che iniziano a schiudersi una settimana dopo. Le uova fecondate si sviluppano in femmine, mentre le uova non fecondate si sviluppano in maschi³. Le femmine sono distribuite nella parte inferiore del tubo delle api e le disposizioni corrispondenti sono più significative. Al contrario, i maschi erano in prossimità dell'uscita del tubo con disposizioni minori⁷, quindi i maschi escono per primi e le femmine escono più tardi. La femmina mescola il polline con una piccola quantità di nettare in un blob umido, l'unica fonte di cibo per ogni larva nella cellula⁸.

Diversi studi hanno riportato una diminuzione della popolazione di insetti impollinatori ^9,10. L'uso estensivo di pesticidi è stato identificato come uno dei principali fattori per ridurre l'abbondanza e la diversità degli impollinatori e può anche mettere in pericolo i servizi di impollinazione^11,12. Per ridurre e mitigare gli effetti negativi dei pesticidi, è necessario condurre una valutazione del rischio dei pesticidi per gli impollinatori. Alcuni paesi hanno stabilito quadri normativi per garantire la sicurezza delle api dai pesticidi utilizzati^13,14. Studi recenti hanno dimostrato che Osmia era più suscettibile ai pesticidi rispetto alle api da miele ^1,15.

È interessante notare che la maggior parte delle valutazioni del rischio si sono concentrate sulle api adulte ^11,12; poche ricerche sono state condotte su O. excavata, in particolare sulle larve. Inoltre, la mortalità di Osmia direttamente causata dai pesticidi è più comunemente considerata¹⁶. Tuttavia, le tossicità croniche come l'aumento di peso larvale, la durata dello sviluppo, i modelli di alimentazione, la capacità di eclosione, il successivo comportamento adulto e la fecondità possono avere lo stesso danno delle tossicità letali acute e sono spesso ignorate a causa della mancanza di un metodo sperimentale efficace per le api solitarie¹⁷.

Fino ad ora, due metodi sono utilizzati per valutare gli effetti dei pesticidi sulle larve delle api solitarie: (1) una quantità appropriata di pesticidi è stata applicata nel punto localizzato di disposizioni senza rimuovere l'uovo delle api solitarie 1,18,19,20; (2) sostituzione delle disposizioni con miscele artificiali di polline e nettare contenenti una quantità specifica di antiparassitario²¹. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni ai due metodi di cui sopra. Il primo può misurare solo la tossicità acuta, ma non la tossicità cronica perché le larve hanno ingerito l'intera dose in un breve periodo di tempo; quest'ultimo porterebbe ad un alto tasso di mortalità a causa della manipolazione umana¹. Qui, il metodo di immersione è stato descritto per studiare l'ecotossicità dei pesticidi a O. excavata in condizioni di ricerca altamente controllate, simulando il comportamento dell'alimentazione larvale con pesticidi residui nelle disposizioni nell'ambiente reale. Il metodo di questo studio risolve gli svantaggi dei due metodi di cui sopra ed è adatto per misurare gli effetti di una sostanza pericolosa sulla tossicità acuta e cronica.

Protocollo

1. Preparazione del tubo di alimentazione

1. Praticare un foro (~ 0,3 mm di diametro) nel coperchio di un tubo di centrifuga da 2 ml utilizzando un ferro da avvolgimento elettrico (vedere Tabella dei materiali). Utilizzare un tale tubo centrifuga per mantenere una larva di O. excavata e la sua massa di fornitura.

2. Preparazione del pesticida

1. Sciogliere il pesticida di grado tecnico (vedi Tabella dei materiali) in acetone per acquisire soluzioni stock di 1 x 10⁴ μg a.i. ^mL-1. Quindi, eseguire diluizioni graduali della soluzione a più di cinque concentrazioni.
   NOTA: in questo studio sono stati utilizzati clorpirifos a 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4 μg a.i. ^mL-1 .

3. Preparazione delle disposizioni

1. Acquisire tubi di plastica per api contenenti provviste (vedi Tabella dei materiali) e larve di O. excavata appena tratteggiate da un programma di allevamento di massa.
   NOTA: Nessun pesticida è stato utilizzato da 20 giorni prima della fioritura all'intero periodo di fioritura; i risultati delle analisi chimiche hanno mostrato che i contenuti di pesticidi comunemente usati in cinquanta disposizioni selezionate a caso erano entrambi al di sotto dei livelli minimi di prova.
2. Separare le provviste e le larve delicatamente usando una spazzola morbida. Seleziona le larve femmine in base alle dimensioni della fornitura e alla posizione della cellula all'interno del nido⁹. Quindi, posizionare provviste di dimensioni uniformi e larve femminili selezionate in piastre di Petri (diametro 60 mm) e metterle da parte per l'uso.
   NOTA: Cinquanta disposizioni sono state selezionate a caso per analizzare il contenuto di pesticidi comunemente usati: clorpirifos, imidacloprid, fendifenuron, phoxim, avermectina. I parametri della spazzola morbida sono (a) diametro del pennello: 0,3 mm, (b) lunghezza del pennello: 2 cm, (c) lunghezza della penna: 18 cm.

4. Fornire un trattamento con pesticidi

1. Immergere le disposizioni selezionate di dimensioni uniformi (dal punto 3.2) in pesticidi diluiti (dal punto 2.1; clorpirifos a 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4 μg a.i. ^mL-1) per 10 s utilizzando una gabbia. Immergere il controllo di controllo (CK) in solvente allo 0,2% (acetone in questo studio).
   NOTA: esistono tre repliche per trattamento di concentrazione e ogni replica consisteva in 60 disposizioni. La differenza di dosaggio di ciascuna disposizione può essere ridotta selezionando disposizioni di dimensioni uniformi.
2. Misurare il volume della soluzione di pesticida prima e dopo aver trattato le disposizioni con il pesticida. Quindi, calcolare il volume immerso di insetticida in ciascun trattamento, comprese le 60 disposizioni di massa (Tabella supplementare 1). Posizionare le disposizioni in tubi centrifughi separati con fori (dal punto 1.1) dopo l'essiccazione all'aria su un piano di lavoro sterile.
   NOTA: prima dell'esperimento, inserire le gabbie contenenti le disposizioni nella soluzione di pesticidi e quindi misurare il volume della soluzione di pesticidi prima e dopo l'ammollo per eliminare l'errore.
3. Trasferire le larve femminili individualmente sulla superficie delle provviste essiccate naturalmente usando una spazzola morbida.
   NOTA: Una larva in un tubo.

5. Condizioni di crescita

1. Allevare le larve di O. excavata in una camera di crescita al buio, 65%-75% di umidità relativa e 25 ± 2 °C¹⁶.

6. Esame dei risultati

1. Il test di tossicità letale acuta
   1. Misurare la mortalità delle larve dopo averle posizionate sul trattamento e le disposizioni di controllo (CK) per 48 ore.
      NOTA: I criteri di morte: quando le larve non hanno risposto al tocco lieve usando una spazzola morbida sotto lampade a luce nera²². Le lampade a luce nera sono state utilizzate per simulare le condizioni di crescita scure delle larve ed evitare l'influenza della luce sulle larve durante il controllo degli indicatori di crescita. Per eliminare l'errore umano, sono state misurate anche le morti con e senza rimozione delle larve dalle disposizioni dopo 48 ore nei gruppi di controllo.
   2. Pesare 60 provviste prima e dopo 48 ore di prove di allevamento di insetti per determinare la quantità di provviste consumata da ciascuna larva.
   3. Calcola la dose di pesticida ad ogni concentrazione consumata da ciascuna larva in base alla percentuale di fornitura consumata e al contenuto di pesticidi in ciascuna fornitura.
      NOTA: L'equazione per il calcolo della dose è²³:
      
      dove, D è la dose consumata di pesticida da ciascuna larva; W1 è il peso di 60 disposizioni prima dell'infusione di pesticida; W2 è il peso residuo di 60 provviste dopo 48 h; V1 è il volume di pesticida prima dell'immersione per 60 disposizioni; V2 è il volume di pesticida dopo l'immersione per 60 disposizioni; C è la concentrazione del pesticida.
2. Il test di tossicità subletale
   1. Pesare le larve prima delle prove di allevamento e dopo 14 giorni di trattamenti per determinare l'aumento di peso larvale.
   2. Osserva O. excavata ogni giorno durante il bozzolo sotto lampade a luce nera per misurare la durata dello sviluppo larvale.
   3. Pesare le porzioni rimanenti di accantonamenti dopo 14 giorni dall'alimentazione con disposizioni trattate e CK per calcolare il consumo e l'efficienza della conversione degli alimenti ingeriti (ICE)²⁴.
   4. Esamina il numero di eclosioni tagliando i bozzoli usando una piccola forbice quando le api di controllo emergono negli adulti.

Risultati

I tenori di antiparassitari di uso comune, clorpirifos, imidacloprid, fendifenuron, phoxim, avermectina nelle disposizioni erano inferiori al limite di quantificazione (0,01-0,02 mg ^kg-1) nel gruppo di controllo; questi risultati hanno escluso l'influenza dei residui di pesticidi su ciascun trattamento. È stata valutata la mortalità con e senza rimozione delle larve dalle provviste dopo 48 ore nei gruppi di controllo; i risultati non hanno mostrato differenze significative (Tabella 1), indic...

Discussione

Per gli impollinatori adulti, ci sono due metodi principali per misurare l'ecotossicità dei pesticidi. Uno è il metodo di contatto, in cui il pesticida viene applicato al protorace degli insetti adulti; l'altro è il metodo di tossicità gastrica, in cui gli impollinatori adulti vengono nutriti con acqua di miele contenente pesticida^25,26. Negli ultimi anni, è stato riscontrato che l'effetto di impollinazione e il tasso di eclosione di O. excavata son...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Abamectin	Jinan Lvba Pesticide Co. Ltd
Black-light lamps	Kanghua Medical Device Co., Ltd
Centrifugal tube box with 100 Wells	Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd
Centrifuge tube	Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd		2 mL;  Serve as bee tube
Electric soldering iron	Kunshan Kaipai Hardware Electromechanical Co., Ltd
Electronic scale	Sartorius Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd	3137510295
Graduated cylinder	Anhui Weiss Experimental Equipment Co. Ltd
Petri dishes (60 mm diameter)	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Pollen provision	Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd
Soft brush	Wengang Wenhai painting material factory
Solitary bees	Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd